DNAはたくさん必要

もうすぐ9月だというのに、まだ暑いですねえ。
私は蚊が嫌いです。　夜中でも殺すまでは寝られません。
書いている今も、どこかに蚊がいるんですよね。　「虫よけ当番」を枕元に置かなきゃ。

ま、それは置いておいて、PacBioは1分子シーケンスを売りにしています。
基本的にPCR増幅はしません。
想像はつくと思いますが、そうするとスタート時にDNAはたくさん必要になるのです。
ちなみに今は、2本鎖のDNAだけ、からスタートできます。

スタート時に必要なDNA量ですが、サイズによっても違いますが、大体、10Kbのライブラリーで読むときは、9μgくらいは必要でしょうか？
と、これはアメリカの受託会社、Expression Analysis （EA）のドキュメントが公開している数値です。
Webで公開しているので書いても良いでしょう。
ドキュメントはここ（http://www.expressionanalysis.com/platforms/category/pacific_biosciences/）
のページの、右上の、Comprehensive PacBio RS Overview　というところからダウンロードできます。

実は、この会社との出会いが、私をPacBioにのめり込ませたのですが、この会社は、アメリカでマイクロアレイやシーケンサーの実験・解析受託をしています。
昨年の6月に、PacBioのサービスを始めて、安定してビジネスを展開しているそうです。

さて、DNA必要量の話に戻りますが、9 μg という数値はかなり多いでしょう。
シェアリングして、End-repairして、Ampure Washして、…と進めていくと、ライブラリーにするころには、750 ~ 1250 ng が予想される回収量になるそうです。
（なるそうです、と書きました。いえ、私も予想回収率くらい知っているんですよ。でもPacBioのプロトコールはWeb公開されていないので、ブログで書くのはまずいからあくまで第三者のふりしてます。詳しく聞きたい方は別途）
EA社はこの場合、20 ~ 35のSMRT Cellが使用できる、と書いています。

で、データはどれくらい出てくるか、ですが、10Kbで90分Movieで読んだとき、生データで最長20Kb、クオリティフィルタリングした後で14.6Kb
平均リード長は、生データで3.7Kb、フィルタリング後で2.6Kb
フィルタリング後のリード数は44,232本、塩基数は116Mb

このデータは、比較的現実に沿った数値です。
チャンピオンデータではありませんが、いろいろなサンプルをやった経験値でしょう。

フィルタリングの条件は、リードにはそれぞれRead Qualityという精度の指標があるのですが、これが 75/100 以上であることと、クオリティの良い部分のリードの長さが50bp以下ではないこと、です。
これにひっかかるリードは除去されます。
そうして残ったリードの、平均長が 2,600 bp、Maxが14,600 bp ということなんですね。

Read Quality 75以上、リード長50bp以上、というのはデフォルトの値です。
50bpでは短すぎるな、と思うときは私はこれを上げていいと思います。


サンプル調整自体は、私もトレーニングを受けましたが、それほど難しいステップはありません。
シェアリングもCovarisの機械任せだし、精製もマグネットビーズでピペット処理だし、アダプターダイマー（アダプター同士の接着）をこれまたビーズで取り除くだけ。
基本プロトコールは順調です。
でも、裏プロトコール？みたいなトラブルシュート的なプロトコールでやったときはほとんどDNAをロスってしまいました。
ラボを離れて約7年・・・の私には、裏プロトコールは難しかった。
とは言っても、基本プロトコールで作った10Kbのライブラリーの方は、ライブラリーまでの回収率は33%で、Good！
ランの結果も、上記EA社の数値と同じくらいでした。


ところで、より少ないスタートDNA量でランできないものでしょうか。
たくさんDNAがとれないサンプルでも、長く読んでみたいという要望はあります。
この要望に応えるための方法は、・・・
公式にPacのWebSiteで公開されたらここでも書こうかと思います！
まだ書けないーっ！