2017年3月6日月曜日

サイズセレクション無しのISO-SEQ Sequel向け



Iso-Seqというのはアイソフォームシークエンス。
数年前から(もちろんそのときはRSIIで)、完全長 cRNAをシークエンスすることで、スプライシングのバリエーションを一気に、連続配列情報として得ることが出来る。
これがIso-Seq です。
最近ではここに書きました
Iso-Seq アイソフォームシークエンスアップデート 植物

RSIIでのIso-Seqは、サイズセレクションといって、1kb、2kb、3kbなど、サイズごとに分けてライブラリを作製、別々のセルでシークエンスしていました。
と・こ・ろ・が・!


このたび正式にリリースされたSequel用のプロトコルでは、サイズセレクションしません。
というのも、Sequel用のケミストリーでは、ローディングバイアス(短いライブラリが優先的にZMWに入る、というバイアス)が、あまり影響しないらしいことが経験的にわかってきたからです。
RSIIとSequel、サイズセレクション無しのとき
Sequelのランはバイオアナライザで測ったときの波形に似ている

サイズセレクションせずに、Iso-Seqの同じライブラリをRSIIとSequelでランしたとき、RSIIは1kb程度のフラグメントがもっとも多く検出されます。
でも、Sequelでランすると2kbあたりに最頻値が現れる。
これはバイオアナライザで測ったときの形に似ているぞ。
ちなみにAMPureは1Xで行なっています。

というわけですが、マグビーズは推奨されています。
また、4kb以上の長い転写産物の出力を増やしたい場合は、4.5kb以上でサイズセレクションをしたほうが良いらしいです

そのたの目新しいこと・・・

  • AMPure精製は、0.40Xと1Xの2通り別々に行い、あとでモル比を合わせて混ぜます
  • PrimeSTAR GXLポリメラーゼを長鎖PCRに使います
  • P1を50%目指します(50%のZMWから使えるデータを出す)
  • 6時間Movieまたは10時間Movieで読みます(時間かかっても精度良いデータをたくさん出したければ10時間)
  • Movieをとる前に2時間シークエンスさせます(Pre-extensionと呼ぶ)
このような変更点があって、プロトコルもだいぶ変わりました。

Sequel では、RSIIで複数個のセルを使っていたIsoSeqが、1個か2個のセルで可能になりました。
今度のAACR(4/1~5)で発表があるかな。
注目してます。


Iso-Seqの新しいプロトコルはこちらから!