サイズセレクション無しのISO-SEQ Sequel向け

Iso-Seqというのはアイソフォームシークエンス。
数年前から（もちろんそのときはRSIIで）、完全長 cRNAをシークエンスすることで、スプライシングのバリエーションを一気に、連続配列情報として得ることが出来る。
これがIso-Seq です。
最近ではここに書きました
Iso-Seq アイソフォームシークエンスアップデート 植物

RSIIでのIso-Seqは、サイズセレクションといって、1kb、2kb、3kbなど、サイズごとに分けてライブラリを作製、別々のセルでシークエンスしていました。
と・こ・ろ・が・！

このたび正式にリリースされたSequel用のプロトコルでは、サイズセレクションしません。
というのも、Sequel用のケミストリーでは、ローディングバイアス（短いライブラリが優先的にZMWに入る、というバイアス）が、あまり影響しないらしいことが経験的にわかってきたからです。

RSIIとSequel、サイズセレクション無しのとき
Sequelのランはバイオアナライザで測ったときの波形に似ている

サイズセレクションせずに、Iso-Seqの同じライブラリをRSIIとSequelでランしたとき、RSIIは1kb程度のフラグメントがもっとも多く検出されます。
でも、Sequelでランすると2kbあたりに最頻値が現れる。
これはバイオアナライザで測ったときの形に似ているぞ。
ちなみにAMPureは1Xで行なっています。

というわけですが、マグビーズは推奨されています。
また、4kb以上の長い転写産物の出力を増やしたい場合は、4.5kb以上でサイズセレクションをしたほうが良いらしいです

そのたの目新しいこと・・・

• AMPure精製は、0.40Xと1Xの2通り別々に行い、あとでモル比を合わせて混ぜます
• PrimeSTAR GXLポリメラーゼを長鎖PCRに使います
• P1を50%目指します（50%のZMWから使えるデータを出す）
• 6時間Movieまたは10時間Movieで読みます（時間かかっても精度良いデータをたくさん出したければ10時間）
• Movieをとる前に2時間シークエンスさせます（Pre-extensionと呼ぶ）

このような変更点があって、プロトコルもだいぶ変わりました。

Sequel では、RSIIで複数個のセルを使っていたIsoSeqが、1個か2個のセルで可能になりました。

今度のAACR（4/1～5）で発表があるかな。

注目してます。

Iso-Seqの新しいプロトコルはこちらから！