バクテリアのIsoSeqをするには？

今日はバクテリアのIso-Seqの話です。
そもそもイントロンが無いバクテリアの転写産物ですが、完全長で読む意義はあります、よね。完全長で読みたい、というニーズはあったようです。

ではどうするか？
CDNAを作る逆転写には、タカラクローンテック社の SMARTer PCR cDNA Synthesis kit を使います。
でもこの逆転写反応には、PolyA-Tail 配列があることが必要です。
しかしバクテリアのmRNAには、PolyA-tail 配列が無い！

そこで最初に、mRNAの3'側に、酵素反応で強制的にPolyA-tail 配列をつけてしまいます。
Epicentre PolyA Polymerase Tailing Kit

しかしこの反応は、rRNAに対しても PolyA-Tail を付加してしまうので、この後 rRNAを除去することが必要です。
Thermo Fisher RiboMinus

流れとしてはこんな感じ

二重鎖 cDNA が得られたら、PCR増幅して、サイズセレクションして、SMRT Bell ライブラリ作って、RSIIでシークエンス

SMRT bell作る前処理の、rRNA probe とのハイブリ効率はどれくらいなんでしょう？
ここでちゃんとrRNAを除いておかないといけませんね。

プロトコルは、Unsupported　つまり、サポート対象外ですが、興味のあるかたはここからご覧下さい