ターゲットリシークエンスと変異 1

ゲノムの変異、広い意味での変異を見つけることは、次世代シーケンサーならではのテーマでしょう。

オーソドックスなのものでは一塩基変異（Single Nucleotide Variant）を見つけること。
ショートリードの世界では例えば、BWAでリードをゲノムにマッピングしてからSAMToolsでSNVを検出する、というようなパイプラインがほぼ確立されているので、多くの研究者の方がチャレンジしているのではないでしょうか。

SNVがコーディング領域のアミノ酸を変えればタンパク質の機能を、遺伝子の転写制御領域にあればmRNAの転写を、直接変化させます。

他にも、遺伝子や重要配列をごっそりDeleteしてしまう変異もありますし、何コピーもAmplifyしてしまう変異もあります。

あとは、染色体単位でのTranslocation、転写・遺伝子レベルではキメラRNAやFusion Gene、新規のAlternative Splicingなんかも変異になるのでしょうか。

ショートリードでは、SNVはそのまま検出可能ですが、大きなDeletion / Insersion、Amplificationは難しいでしょう。　
リードは長くても100－150bp（HiSeq、MiSeqなど）です。
マッピングアルゴリズムにもよりますが、10塩基以上のInDelを検出できるツールを私は知りません。（あったら教えて）　

そのSNVですが、ショートリードの世界では良く、カバレージは最低何X必要などと言われます。
これについてはいろいろな意見があると思いますが、以前学会や展示会で聞いて回ったところ、普通のDiploidのジェノタイプ（つまり50:50）には20X、ちょっとレアなSNV（80:20）には100～120Xは必要だと言われた記憶があります。
根拠が薄くてすみません。　でも今のHuman Exomeなどでは、HiSeqやSOLiDを使えば普通にこれくらいのカバレージは「平均で」出ますね。


では、PacBioのシーケンスではどうでしょうか？
SNVを見つけるには、どれくらいのカバレージが必要なのでしょう？

このテクニカルノートは最近出されたものです。
面白かったのでサマリーを紹介します。

まずは最初に単語の説明から
Continuous Long Read (CLR): 長いインサートを一本で読んだ時のリード
Circular Consensus Sequencing Read (CCS): 短いインサートを数回読んだ時のリード

CLRとCCSにはどんな特徴があるのでしょうか？

フルパスで一回読んだだけのCLRは、精度85－90%、塩基あたりのQVは8.25－10で、平均リード長は2kb、これを10XのカバレージにするとQVは30以上（99.9%以上）になるそうです。　

一方CCSは、2回パスを読んだものでリードの精度が97%、3回パスで98%、5回パスで99%ということになっています。　5回読めば1kbあたりのエラーは10塩基未満に抑えられるということ。
塩基のQVも、2パスで13、3パスで17、5パスで20以上となり、なんとか耐えられます。
10XのカバレージにするとQVは50以上になるそうです。

これと、重要なのが、SMRT Cell 1つで出力される「使える」リード数です。
「使える」リードとは、CLRでは1回のフルパスサブリード、CCSでは3回以上のパスで出力されるリード、と定義してみます。
45分のムービーを2回撮ったとき（C2ケミストリー）の設定です。
CLRは、500bpインサートで250,000本、1kbインサートで100,000本、2kbインサートで50,000本。
CCRは、500未満bpインサートで40,000本、500bpで30,000本、1kbで15,000本。

ここで問題：　あれあれCLRの500bpインサートが25万本を出力しています！　ZMWは15万/Cellしかないのに。

答え：　サブリードですので、1 SMRT Cell あたり2以上を出力している（かもしれない）のです。
CLRで500bpのインサートを完璧に1周したら2本のサブリードが出ます。
45分のムービーなので十分ありえます。

続く・・・