Pacの一次解析 その１

今日はPacの一次解析について書きます。
NGSではおなじみですが、ご存じない方のためにちょっと説明すると、一次解析、二次解析、三次解析というのあって、それぞれ、

1. 一次解析：　シーケンサーから出てきた生データから、塩基配列を求める（ベースコールする）
2. 二次解析：　塩基配列になったリードデータを、アセンブルまたはリファレンスにマッピングする
3. 三次解析：　マッピングされたデータをもとに、Contigをつなげたり、配列から何か意味のある現象（例えば発現量や変異など）を得る

という意味です。

一次解析は、最初の基本的なところなので、データの精度や結果に大きく影響しますね。
以下は全て、シーケンサーの横にあるBlade Center、というベースコールサーバーで行われます。

PacBioのシーケンサー生データは、Movieです。
Movieはとてつもなく大きなデータで、1秒間に3Gbも出てきます。
これはメモリ上に展開されるだけで、すぐに圧縮されてトレースデータ、という形で保存されます。
この、Movieからトレースデータへ、「Movie-to-Trace」 という部分が、Real Timeで行われているのです！
SMRT Cell のSingle Molecule "Real-Time" ですね。

Movieから変換されたトレースデータは、それでも1Cellあたり、50～150Gbもあります。　（Movieの時間によってサイズが異なります）。
トレースデータは、各ZMWから放出された、計測したPhotonの量（光量子束、photon flux）を数値化したものです。
各カメラから計測されたPhotonの推定量と、蛍光ごとによるPhotonの推定量とを使って、何やらノイズを取り除くノーマライズをしています・・・。
これ以上説明せよと言われてもできません。　ごめんなさい！

まあ、ざっくり言うと、動画から蛍光ごとに区別した波形データを作っているんですよ！

で、このトレースデータは、まだ塩基ごとの波形がばらばらなので、もうちょっと見やすく、さらにノーマライズしたのがパルスデータです。

トレースからパルスへ、「Trace-to-Pulse」変換が行われます。
この変換の最終目的は、ポリメラーゼがDNAを読んだ時の、パルスの正確な検出と、他との区別をすることにあります。

トレースデータはまだ、塩基ごとの区別があいまいなんです。　それを、閾値を設けてノイズをできるだけ取り除き、ほかの塩基としっかりと区別できるように変換したのがパルスデータなんです。

パルスデータには、重要なKinetics情報が含まれます。例えば、

1. パルスの高さ　Intensity, or Pulse Height
2. パルスの幅　Duration, or Pulse Width  (PW)
3. パルス間の時間　Spacing, or Interpulse distance  (IPD)
4. 塩基の種類　Content, or Base identity

などです。

次にようやく、パルスデータからベースデータへの変換、「Pulse-to-Base」が行われます。