年越し前に、今年最後のアップデートの話

NGS現場の会・第3回研究会で、PacBioのリードがあと2か月で平均8.5Kbpに伸びる、と発表しました。
試薬・酵素と、Movie時間のアップデートで可能になるのです。　もうリリースしてユーザのアップデートもほぼ完了したのでこの話は年明け前にしておかないと。

先ず、試薬・酵素

PacBioの酵素はPolymeraseでP、試薬はChemistryでC、と表します。
組み合わせは、P4C2とか、P5C3とか、で略します。

といっても、少し前まで、XL酵素とXL試薬、C2酵素とC2試薬という厄介な名前のものがあり、XLC2、XLXL、C2C2と略すとどっちがどっちだ！ということも良く聞かれました。
ちなみにXLC2はXL酵素とC2試薬、XLXLはXL酵素とXL試薬、C2C2はC2酵素とC2試薬の略です。
それがややこしいというのはアメリカでもクレームがあったらしく、これからはPとCではっきり分かるようにさせたということらしい。

それはともかく、今のシークエンスに使われているのは、P4C2です。
P4は、2013年の夏ごろリリースした酵素です。
C2酵素よりも安定してロングリードを作ることができる酵素です。
P4C2で読んだとき、120分Movieでは平均リード長4500bpを出していました。

C2試薬（酵素では無い）は、ヌクレオチドと蛍光色素の距離が近く、レーザーが照射したとき、蛍光色素からのエネルギーが酵素に移動するため、それによって酵素の活性が失われやすいという欠点がありました。
そこで、ヌクレオチドと蛍光色素の間に、分子を入れて、レーザーによる励起エネルギーが酵素に届かないように改善、これがC3試薬の登場です！

左側がC2試薬と酵素X、右側がC3試薬と酵素X
Protecting Scaffoldというのが、ヌクレオチドと蛍光色素の間に新たに挿入した分子です。
これがC3

C3試薬を使うと、レーザー光によってDye（蛍光色素）が出すエネルギーが、Protective Scaffold（分子）によって遮られ、酵素には届かない、という図

こうしてC3試薬が生まれ、酵素との組み合わせ実験がR&Dにて行われました。
P4酵素とC3試薬はあまり組み合わせが良くなかったのです。
夏前からいろんな酵素を試していて、最終的に残った、一番成績の良い酵素君が、P５と名付けられました。


次にMovie時間アップデートの話

今までは120分がMovie時間のMaxでしたが、これを180分まで読めるようにしました。
Movie時間を変えるのはソフトウェアをちょっと変えれば可能なので、実は、酵素が180分たっても大丈夫、になったことの方が大きい。
120分で読んだ時の1.5倍かかるわけですから、1日何セル読めるかは、新たに計算する必要がありますね。
今までは120分Movieで8セル読むとすると、機械にセットしてからデータ転送が終わるまで20時間くらいでした。180分Movieだと、おおよそ28時間。


以下のグラフは、カタログでも登場するものです。　
大腸菌ゲノムで、20Kbpライブラリを作り、Blue Pippinでサイズセレクションして、180分Movieで読んだ時の平均データです。

平均リード長5500bpのP4C2は、今まで通り、デノボアセンブリやcDNAシークエンスなどに向いています。
同8500bpのP5C3は、精度がP4C2に比べて低いので、今のところスキャフォールドへの使用を推奨しています。

私たちもそのうち、こうしたデータを公開しようと思います。
でも、ポリメラーゼリード単位のデータでは、へー、で終わってしまう。
やっぱりサブリードのグラフも欲しいし、実際アセンブリした結果も欲しい。
なので、公開するときはそういうデータも一緒に。