リード長とインサート長の関係

先週の「現場の会」で私の喋りの後の質問の中で、ひとつ、深く考えさせられるものがありました。
「リード長を伸ばすために常に酵素を開発しているということだが、酵素をより良いものに変えるのと、インサートの長さと、どちらがクリティカルな問題なのか？」

つまり、酵素を良くすれば長いリードが読める。90分どころか120分、240分レーザー当てても死なないで塩基を読める酵素も出てくるかもしれない。
しかし、一方で、インサートの長さを今の10kbから20kb、30kbと伸ばしていって、これがちゃんと読めるようになるのか？
このせまい小さなZMWの穴に入ることができるのか？

化学的な条件と、物理的な条件と、どちらがよりクリティカルなのか？　ということですね。

今のC2ケミストリーでは、10kbまでのインサートを読むことができて、90分Movieで読んだとき、リード長は平均3.5kb、95パーセンタイルでは8kb、最長は15kbくらい、ロングリードでの精度は約85%です。

-----------------ここから先は仮定の話を前提にしていますので注意！--------------------

これが将来、もし、30kbまで読めるようになったとしましょう。　
でも、30kbまで読める、ということと、30kbのインサートが読める、ということは別ですね。
10kbのインサートを1周半（sense + antisense + sense）読めば30kbですから、30kb読める、ということにウソは無いですね。うん、正しい。
でもちゃんと説明しないと、普通、「すごい！それって30kbのインサートが読めるってことでしょ？」って誤解するでしょうね。　うんうん。
（そのときもっと長いインサートも読めたら最高ですが）

で、30kbのインサートを読めるか？ってことになると、今度は物理的な問題ですね。　ZMWの穴の中に効率的に入らなければいけませんから。
短いインサートの方がZMWに入りやすいってことは知られていますので、マグネットビーズでロングの（今は10kbですが）ライブラリーを効率的にZMWに誘導する方法は、開発されています。　学会のポスターでも発表されていますのでご存じの方もいるでしょう。



・・・・・　と、ここまでぎりぎり公開OKな話でした。

リード長が伸びたとしても、それは読める範囲（インサート長）が伸びた、ということとイコールではないので、誰かに説明するときはこれから注意します。
初めて聞いたひとは絶対誤解すると思いますから。

このブログを読んだあなたは、もう間違えませんよね。




これは私が「現場の会」で喋った、という証拠写真（現場の会・アルバムより拝借）

PacBio RS に付属するソフトの概要

この間「NGS現場の会」で、参加者のひとたちと話していて、気づきました。
PacBio RS に付属するソフトウェア、について今までブログで全然触れていなかった、と。

"PacBio RS Software and Data Analysis" という、最近出来立てのチラシがあるんですが、その中にこんな絵があります。

中央下のシーケンサーから時計回りに、

• RS Remote
• RS Touch
• SMRT Portal
• SMRT View
• DevNet

とあります。このうちDevNetはPacBioのサイトで、開発中のツールなどを提供しているもので、今日は含めません。

では、順番に説明します。

1. RS Remote：　ユーザの用意したWindows PC にインストールします。　ここでランの設定や、実行中のランの様子を確認します。　終わったランの、時間軸でのジョブの様子を見ることもできます（例えば何時に何番目のセルのランが行われていたか、など）
2. RS Touch：　シーケンサー本体にインストールされていて、タッチパネルから操作します。　主に、RS Remoteで設定し保存されたランを、実行する時に使います。　実行中のランの様子をここからも確認できます。　装置のエラー（温度やレーザーの異常、データの転送エラー）などがあれば、この画面に表示されます。
3. SMRT Portal:　ユーザが2次解析を行うときのウェブブラウザアプリです。　ユーザは、用意したLinuxサーバに、SMRT Analysis という2次解析ソフトをインストールします。　SMRT Portalは、このSMRT AnalysisソフトのGUIで、Internet Explore, Fire Fox, Google Chrome のブラウザに対応しています。　SMRT Analysisについては後ほど。
4. SMRT View：　いわゆるゲノムブラウザです。　Java で動き、Mapping の結果などを参照できます。

これらのソフトは似たような名前なので、最初は良くごっちゃになりました。　

特に、RS RemoteとRS Touchは機能が似ている上、名前も似ている。

そしてこれはデータの流れをまとめた図。 

ランの設定をするのがRS Remote（左下）

シーケンサー本体のRS Touch上でランを実行したら1次解析のデータ（ベースコール結果）が作られます。　この1次解析自体は、シーケンサー横の黒いベースコールサーバ（Blade Center）内で行われます。

1次解析データは、HDF5という階層型のデータフォーマットと、生のFastq、Fastaデータが含まれ、これらは自動的にユーザのストレージサーバに転送されます。　

次に、WebアプリであるSMRT Portal（中央下）から、ユーザは、SMRT Analysisにアクセスします。

SMRT Portal上で、ユーザは、ストレージサーバに転送された1次解析データをクエリに、2次解析（MappingとかAssemblyとか）の設定をします。

SMRT Analysisはストレージ内の1次解析データを呼び出し、計算をして、BAMやSAMなどの結果を指定した場所に書き込みます。

ちなみに2次解析のコマンド群をSMRT Pipeと呼んだりします。　

GUIで行いたい方向けに、SMRT Portalがあるんですが、CUIがいい！ってひとはこのSMRT Analysisをコマンドべースで使うのももちろんOK

SMRT Analysisの解析メニューは、

1. BLASR（ブレイザーと発音）というPacのロングリードに向いたアライメントツール
2. GATKのGenotyperを使用したSNP検出ツール
3. ALLORA（アローラと発音）という名のアセンブラー
4. ギャップフィルタリングやScaffoldingをするAHA（アハッ）
5. そしてMethylation 検出

の5つが柱。　5のMethylation検出は今度のバージョン1.3.1から新たに加わります。　

これらについては、そのうち、例を出しながら書く予定。

さて、SMRT Analysisはユーザがサーバにインストールするわけですが、どんなサーバを用意すれば良いのでしょうか？

OSはUbuntu 10.0.4以降、CentOS 5.6以降

MySQL、bash shell、Perl v5.8.8以降、Perl XML parserがインストールされていることが必要です。

ハードウェアの最低条件

ヘッドノード：　16GB～32GBのメモリ、250GBのスペース

子ノード（5つ）：　コアあたり2GBメモリで、ノードあたり8コア、250GBのスペース

ストレージ：　約10TB

これに満たなくても動くことは動きます。

ただ、遅いかも。

メモリは多いに越したことはないけれど、ストレージのディスクを速いのにしたほうが、実行速度は高まるらしいです。　

私は、感覚的にはそうかなあ、って感じですが。

ということで、ユーザがインストールしなくてはならないのはRS RemoteとSMRT Analysisの2つ。

RS Remoteは普通のWindows PCで動くで問題無いが、SMRT AnalysisはそこそこなスペックのLinuxサーバが必要。

特に、大きなゲノムサイズに挑戦するには、メモリは多い方が良いです。

現場の会

先週、「NGS現場の会・第二回研究会 in 阪急エキスポパーク」に行っていました。
私はその前日チュートリアル、というところで1時間時間を頂き、喋ってきました。
PacBioについて、その原理と特徴、PacBioを使ったアプリケーション例などなど。

プレゼンの前の日は大阪入りして、ホテルで夜3時までスライド作って練習していました。
当日は、最初は緊張してレーザーポインタが震え・・・

私の前はRoche、Illumina、LifeTechと続き、そしてPacBio
それぞれのシーケンステクノロジーの特徴が一日でわかる！って感じですばらしい。

終わってみて、話したいことは大体伝わったかな、という感じはします。

あと、 ブログを知っているひとはかなりいました。　最初、みんなに質問したのですが、300名弱ほどオーディエンスがいたそうですが、3分の1くらい手を上げてくれました。

こんなにマニアックなトピックなんですが。

うれしいことです！

いろんな参加者と話ができて、夜はお酒も入って、ゆるーい感じの学会？です。

ゲノム、メタゲノム、リシーケンス、計算技術、IT、メーカー・・・などなど、その筋の方々、特に現場の方々がそろってわいわいやる。

こういうの良いですね。

この業界は意外と横のつながり、というかメーカーや企業の壁を越えての知り合いは多いのです。

競合の会社でも、社員（現場）のレベルでは飲みに行ったりとか。

でも、これだけたくさんの研究者が一同に集まると、もっともっと輪が広がり、新しい出会いがありました。

前のブログ「ショートリードの憂鬱」を知っているひとから声をかけられ、一気に50人くらい新しい知り合いが増えました。

現場の会に感謝です！　

P.S.

私のプレゼンだけ、白黒コピーでした。　他の企業はカラーできれいだったのに。

これには理由があるんです。

23日の午前2時からKinko'sのサイトがメンテナンスになり、ウェブから印刷を注文できなくなったので、3時に書き上げた私は焦り、とりあえず4時前に寝て、朝8時ごろ北梅田のKinko'sまで20分かけて歩き、印刷を注文したんです。

白黒プリンターは2台あるので印刷が速いと言われたので、時間に追われて白黒印刷にしたわけです。

しばらくブログ更新をしていませんでしたが、これから行きますよ！