今年ほど、桜満開の時期が短いと感じたことはなかったなあ。
7月のNGS現場の会に向けて、「お花見メタゲノム」の試料採取が、全国で行なわれているみたいですね。
私のFacebookの友人も、採取の様子をいろいろアップしていまいた。
結果が楽しみです！
さて、今日は、PacBioではあまり今まで話題に出てこなかった、ターゲットリシークエンスの話
リシークエンスには大きく分けて、全ゲノムリシークエンスと、ターゲットリシークエンスの2種類あります。
前者はゲノム全体をガッツリ読む方法で、後者は例えばExomeなどのような遺伝子のエキソン領域だけを濃縮して読む方法です。
濃縮キットは（「エンリッチ」キットとも呼ばれますが）、ゲノム配列を断片化したあと、
- 取ってきたい（シークエンスしたい）配列領域にデザインされたプローブをハイブリして、エンリッチする方法
- 読みたい配列の両端にPCRプライマーを設計して、そこだけPCR増幅して、取ってくる方法
の2種類あります。
ハイブリ方式か、PCR増幅方式か
市場で良く聞く製品だと、SureSelect (Agilent社)や、SeqCap EZ (Roche社)などは、ハイブリ方式
Ion AmpliSeq(LifeTech社)は、その名の通り、Amplification（増幅）方式
これまで、どの方式、どのキットも、PacBioのロングリードには対応していませんでした。
PacBioで読むには、エンリッチした後の配列長が、そこそこ長くなくては意味が無い！
そんな中、ハイブリ方式で6kbフラグメントのターゲットエンリッチメントに成功したのが、この論文
 |
| Wang et al. BMC Genomics (2015) 16:214 |
Baylor College of MedicineのDr. Min Wangらは、彼らのエンリッチ方法を使って、Potocki-Lupskiシンドロームの患者に見られる、chr17p11.2の複雑な構造変異、Low Copy Repeats (LCRs; またはSegmental Duplications )のブレイクポイントを、検出することに成功しました。
そもそも何で、ゲノム全体を読まずに、特定の箇所をエンリッチして読むのか？
興味のある場所がゲノム全体の数%だったら、そこだけを濃縮（エンリッチ）してきて、PacBioの超ロングリードでがっつりカバレッジ稼いで読めば、かなり消耗品を節約できます。
ゲノム全部を読む必要が無いひとにとっては、エンリッチメントはかなり効率的な手段なのです。
彼らは、Roche NimbleGen社の、SeqCap EZ エンリッチメントキットを使用して、つまりハイブリ方式で、ターゲット領域を濃縮、PacBioで読むことに成功しています。
この方法は、PacBioのアプリケーションノートでも紹介され、今後、本格的に広まる予感がします。
通常、SeqCap EZのプローブは、200bpのフラグメントに対してハイブリするようデザインされています。
これを、彼らは、6000bpのフラグメントでも可能であることを示しました。
ゲノム全部を読む必要が無いひとにとっては、エンリッチメントはかなり効率的な手段なのです。
彼らは、Roche NimbleGen社の、SeqCap EZ エンリッチメントキットを使用して、つまりハイブリ方式で、ターゲット領域を濃縮、PacBioで読むことに成功しています。
この方法は、PacBioのアプリケーションノートでも紹介され、今後、本格的に広まる予感がします。
通常、SeqCap EZのプローブは、200bpのフラグメントに対してハイブリするようデザインされています。
これを、彼らは、6000bpのフラグメントでも可能であることを示しました。
まず、ゲノムDNAを、G-tubeで10kbに断片化します。
その後、Blue Pippinというサイズセレクション機器を使ってゲル泳動し、5~9kbの長さのフラグメントだけを抽出します。
SeqCap EZ アダプターをつけたあと、増幅し、プローブとハイブリします。
ハイブリしなかったDNA断片（濃縮ターゲットではない部分）をWashして捨て、ハイブリした断片（濃縮ターゲット）を回収します。
もう一度、回収DNA断片を増幅し、それからSMRT Bellライブラリ作製にかかります。
このようにして、ハイブリ方式で濃縮したDNA断片から作製したライブラリを、実際にシークエンスしたデータは、かなりの数のライブラリが6kbのサイズを保っていたことを示しました。
実際にHG19ヒトゲノムリファレンスにマップしたところ、マップされたReads Of Insert（ライブラリの長さにほぼ等しい）の平均長は、4.3kb～4.7kb
これだけの長さのリードを濃縮できた例は、私は聞いたことがありません。
論文に出ているとはいえ、まだこのプロトコルはPacBio公式ではありません。
もし試してみたい方は、うまく行かない可能性も無くは無い、ということを頭に入れて、お試し下さい。
どんな遺伝子でもエンリッチできるのか？
SeqCapEZ のプロトコルにはどんな工夫があるのか？
データ解析ツールはどんなふうに使ったら良いのか？
などなど知りたいことはありますが、またフォローしていきますのでお楽しみに！
その後、Blue Pippinというサイズセレクション機器を使ってゲル泳動し、5~9kbの長さのフラグメントだけを抽出します。
SeqCap EZ アダプターをつけたあと、増幅し、プローブとハイブリします。
ハイブリしなかったDNA断片（濃縮ターゲットではない部分）をWashして捨て、ハイブリした断片（濃縮ターゲット）を回収します。
もう一度、回収DNA断片を増幅し、それからSMRT Bellライブラリ作製にかかります。
このようにして、ハイブリ方式で濃縮したDNA断片から作製したライブラリを、実際にシークエンスしたデータは、かなりの数のライブラリが6kbのサイズを保っていたことを示しました。
実際にHG19ヒトゲノムリファレンスにマップしたところ、マップされたReads Of Insert（ライブラリの長さにほぼ等しい）の平均長は、4.3kb～4.7kb
これだけの長さのリードを濃縮できた例は、私は聞いたことがありません。
論文に出ているとはいえ、まだこのプロトコルはPacBio公式ではありません。
もし試してみたい方は、うまく行かない可能性も無くは無い、ということを頭に入れて、お試し下さい。
どんな遺伝子でもエンリッチできるのか？
SeqCapEZ のプロトコルにはどんな工夫があるのか？
データ解析ツールはどんなふうに使ったら良いのか？
などなど知りたいことはありますが、またフォローしていきますのでお楽しみに！
0 件のコメント:
コメントを投稿