40kbライブラリ&6時間シークエンス最強説

「40kbライブラリと6時間シークエンス」で、驚きのアセンブル結果！
本当は10月最初の話題はこれにするつもりだったのですが、新型機械の発表があったもんだから、インパクトに欠けてしまいました。

でも、8月に実際シークエンスをしてみて、アセンブルしてびっくりしたのでせっかくだからシェアします。
（公開にあたりサンプル提供者の許可は得ています）

このサンプル、腸管出血性大腸菌O111は、ゲノムの中に20kb～30kbのリピートが多く、ショートリードではアセンブルがとても難しい。
PacBioでも、一昔前の酵素では、同じように複雑なゲノムであるO157:H7ゲノムは200カバレッジで読んでもContig数は9本でした。
（Koren S., et. al. (2013) Reducing assembly complexity of microbial genomes with single molecule sequencing. Genome Biology, 14:R101　Table 3）


そんなところに、この度、最長Movie時間が4時間から6時間にバージョンアップ！
6時間シークエンスということは、超長いライブラリを作成すれば、長いサブリードが得られ、結果アセンブル結果も改善できるはず。

ということで、

• 40kbライブラリを作製
• サイズセレクションをよりシビアに
• 4時間または6時間でシークエンス

を試しました。

40kbライブラリを作製するには、それなりに長くゲノムを切ることが必要。
今までのG-tubeではなく、Megaruptorという機器を使って切りました。
Megaruptorについてはこちら

この機械で何回かテストカットして、Pippin Pulseに流して確認。
本番カットでゲノムを40kb Shearingしたら、PacBio SMRT bellライブラリ作製へ。

ライブラリができたらおなじみBlue Pippinを使ったサイズセレクション
普通は7kbカットオフとか10kbカットオフとかを行なっていますが、ここでは17kbカットオフをした。
17kb未満のサイズのライブラリを捨てて、それ以上の長いライブラリだけを回収するというわけ。

さて、そのようにしてできたライブラリを、4時間と6時間でシークエンスしたら・・・

リード数は4時間より6時間の方が多いですが、これは偶然でしょう。
平均リード長は、4時間が9kb、6時間が10kb
平均サブリード長は、4時間が8kb、6時間が8.7kb
すごく長いというわけではないけれど、20kb、30kb超えのサブリードも結構ありましたので、これでHGAP3アセンブルを試みた。

Contig数はどちらも4本
最長Contigはどちらも5.32Mb
6時間Contigの配列でDot Plotを作ってみると、確かに、20kbから30kbの長さのリピートが多く含まれていた。
おおーっ！すごい！

6時間で作ったContigに、再度サブリードをマップして作られた、カバレッジグラフを見てみると、染色体5.32MbのContigは、60カバレッジ～140カバレッジであることがわかりました。
カバレッジが高い場所は、ORIであるかも知れない。
ほかのContigは、プラズミドかな？　これはその道の専門家に調査をお願いしています。


さて、結果としては、4時間でも6時間でも、このゲノムの染色体はつながりました。
ちゃんと精査する余地はまだ残っているとしても。


せっかくなのでもっとすごいリード、サブリードの例もお見せします。
これは別の大腸菌です。

リード数も6万本、7万本と、さっきの株より多いけど、リード長はもっとすごい。

平均リード長は、4時間が15.6kb、6時間が18.2kb
平均サブリード長も、4時間が13.2kb、6時間が14.4kb

もちろんこのデータでも、染色体ゲノムのアセンブル成功
20kbのリピートも何のその！　です。


もちろん、このようにサイズセレクションをシビアにすると、捨てられるDNA量も多いですから、最初に用意すべきDNA量は大変多い（10マイクロ～30マイクログラム）です。
これがネックでしょうね。少量DNAからもこのような長いライブラリを作れたら良いのですが。