Iso-Seqというのはアイソフォームシークエンス。
数年前から（もちろんそのときはRSIIで）、完全長 cRNAをシークエンスすることで、スプライシングのバリエーションを一気に、連続配列情報として得ることが出来る。
これがIso-Seq です。
最近ではここに書きました
Iso-Seq アイソフォームシークエンスアップデート 植物
と・こ・ろ・が・！
このたび正式にリリースされたSequel用のプロトコルでは、サイズセレクションしません。
というのも、Sequel用のケミストリーでは、ローディングバイアス（短いライブラリが優先的にZMWに入る、というバイアス）が、あまり影響しないらしいことが経験的にわかってきたからです。
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| RSIIとSequel、サイズセレクション無しのとき Sequelのランはバイオアナライザで測ったときの波形に似ている |
でも、Sequelでランすると2kbあたりに最頻値が現れる。
これはバイオアナライザで測ったときの形に似ているぞ。
ちなみにAMPureは1Xで行なっています。
というわけですが、マグビーズは推奨されています。
また、4kb以上の長い転写産物の出力を増やしたい場合は、4.5kb以上でサイズセレクションをしたほうが良いらしいです
そのたの目新しいこと・・・
- AMPure精製は、0.40Xと1Xの2通り別々に行い、あとでモル比を合わせて混ぜます
- PrimeSTAR GXLポリメラーゼを長鎖PCRに使います
- P1を50%目指します（50%のZMWから使えるデータを出す）
- 6時間Movieまたは10時間Movieで読みます（時間かかっても精度良いデータをたくさん出したければ10時間）
- Movieをとる前に2時間シークエンスさせます（Pre-extensionと呼ぶ）
このような変更点があって、プロトコルもだいぶ変わりました。
Sequel では、RSIIで複数個のセルを使っていたIsoSeqが、1個か2個のセルで可能になりました。
今度のAACR（4/1～5）で発表があるかな。
注目してます。
Iso-Seqの新しいプロトコルはこちらから！
