2018年3月 最近のIso-Seq論文

3月になって東京も少し暖かくなってきましたね。
予報によると桜の開花は東京は3月17日だそうで、平年より早め。
ところが先週行った沖縄では、桜の木は既に緑でした！
沖縄では桜は毎年1月下旬に開花するらしいです。といっても最初から葉桜とのこと。
桜吹雪は無く、散るときはツバキみたいに花被全体が落ちるらしい。

さて、今日は久々にIso-Seqの話題
PacBioのIso-Seqメーリングリストがあってそこから送られてきた最近の論文リストを紹介します。

１．Minio et al. Isoform-scale annotation and expression profiling of the Cabernet Sauvignon transcriptome using single-molecule sequencing of full-length cDNA

２．Yan et al. SMRT-Cappable-seq reveals complex operon variants in bacteria

３．Workman et al. Single-molecule, full-length transcript sequencing provides insight into the extreme metabolism of ruby-throated hummingbird Archilochus colubris, Gigascience (2018)

4．Balazs et al., Long-Read Sequencing of Human Cytomegalovirus Transcriptome Reveals RNA Isoforms Carrying Distinct Coding Potentials, Scientific Reports (2017)

5．Cheng et al., Long-read sequencing of the coffee bean transcriptome reveals the diversity of full-length transcripts, GigaScience (2017)

この中でも２のバクテリアIso-Seqは今までに無くて面白いかも。
Iso-Seqというと、真核生物のmRNAのスプライスバリアントを一気に読みぬくことができる強み、が特徴です。
でもバクテリアは、、、イントロンありませんよね？

そこでバクテリアのIso-Seqは何が見れるのかというと、

オペロンです！

オペロンって、分子生物学・分子遺伝学の最初の方で習いました、よね？
プロモーター、転写開始点、終了点などを初めて習うところで。

Yan et al. SMRT Cappable-seq

バクテリアのmRNAにも poly-A 配列があります。
最初の cDNA は、オリゴ dTを含むRTプライマーによって逆転写で作られます。
不完全に作製された cDNA はRNase I によって排除。
次にTerminal Transferaseによって cDNA の３’側にPoly-G が付けられます。
2本鎖目の cDNAとその後はPCR増幅によって作られていきます。

Yan et al., SMRT Cappable-seq

その後USER（NEBの酵素名）によってdUracilは除去され、スティッキーエンドが作られます。その後、SMRTbellライブラリが作成される、という流れ。

著者にNEB社が入っているので酵素はクローンテック社のものでは無くNEB社のもので完結しています。
そこは少しPacBioオフィシャルプロトコルと違うところです。

で、このバクテリアIso-Seqを大腸菌でやってみたところ、なんと40%の転写終了点が遺伝子リードスルー（日本語訳わからん）だったとのこと。
この技術は真核生物のスプライスバリアントと同じくらい、バクテリアオペロンのバリアントもたくさん存在することが明らかになるかもしれませんね。