バクテリアマルチプレックスシークエンス

Sequel のスループットは、RSII より多いです。

Movie時間やライブラリの種類によって変わりますが、一般的にRSIIでも1セルあたり550Mb~1Gb のデータは出てきます。

一方Sequelは、3Gb~7Gb のデータが出ます。

ポリメラーゼリードの分布はこのような感じ。

1セルで7Gbものデータが出ると、高等真核生物のような大型ゲノムのアセンブリには向いているんですが、バクテリアサイズのゲノムにはそのままではオーバースペックなんですね。

そこで誰もが思いつくのがマルチプレックス。

バーコードをつけて、多検体を一度にシークエンスし、解析のところでバーコードごとに振り分けて検体ごとにHGAPする方法です。

その公式プロトコルができあがりました。解析ワークフローはこちらにあります。

この方法を簡単にまとめると

• 10kbライブラリをつくる（ゲノムを切るとき10kbをターゲットにする）
• ゲノムを切った後はExo VII酵素で切れ端一本鎖を処理する
• バーコード付きのダンベルアダプターをDNAの両端にライゲーションする
• ライゲーションした後複数サンプルを混ぜる
• 5Mbゲノムなら12サンプルまで、2Mbゲノムなら16サンプルまで一度に混ぜることができる（Sequelのとき）
• サイズセレクションにBlue Pippin は使わないで、0.45X AMPure PBを使用する
• 解析はSMRT Link4.0 以降のソフトウェアで行なう

なぜ20kbでなく10kbライブラリを作るのか？
バーコードはインサートDNAの両側のアダプターについています。
そのアダプター配列を正しく読むためには、10kbくらいがちょうど良い長さなのです。
もちろんもっと短くても、ほとんどのポリメラーゼが端っこのアダプターまで到達するでしょうが、あまり短いとデノボアセンブリに向きませんね。
20kb のインサートだと、端っこのアダプターまで到達するポリメラーゼの数は半分以下か、もっと少なくなります。
それでは得られるデータが少なくなるのでマルチプレックスする意味が無い。

バーコードを認識するにはアダプターまで読みぬかないとダメ

ライブラリの長さとバーコード認識の比率はトレードオフの関係なんです。
ということは、ですね、とても長いリピート配列を含むゲノムには向いていないのです。
30kbのリピートが存在するゲノムをつなげるには、30kb 以上のライブラリが必要。
それだとバーコードまで届かない・・・。ジレンマ

でも、そこまで長いリピートを持たないバクテリア、または染色体を完全につなげなくても良い場合などはマルチプレックスをすることでコストを大きく引き下げることができます。

必要ゲノムDNAの量は？
DNAシェアリング（切断）した後のステップは、Exo VII酵素処理です。
ここで必要な検体あたりのDNA量は、
4マルチプレックスの場合：250ng
8マルチプレックスの場合：125ng
10マルチプレックスの場合：100ng
12マルチプレックスの場合：83ng
全体量で1μgがあれば良いのです

バーコード付きのアダプターは自分で作るの？
売ってます。PacBio Barcoded Adapter Complete Prep Kit.という名前で。
お勧め配列があるのでそれをつかいます

混ぜるときの注意点は？
DNA切ったときの切れ具合が、混ぜるサンプル間で似ていることが重要！

10kb狙って切ったとして、Bioanalyzerで確認して、もしも大きく切れかたが違った場合、DNA濃度をもとにして均等に混ぜるよりも、モル数を同じにして混ぜないと、均等にならない恐れがあります。注意しましょう。


ランニングコストはいくらになる？
12種類のバクテリア（ゲノムサイズ5Mb）を、この方法でバーコード付けてマルチプレックスで読んだときの、1株あたりのコストは、55,000円（2017年2月現在・Sequelの1セル使用時）

Oxford Nanopore Technologies (ONT) と PacBio のデータ比較論文

昨日は東京も2月の雪！
20代の前半をカナダの極寒で過ごしたので寒さには強いと思っていたんですが、やっぱり年取ったせいでしょうかねえ。寒いの嫌いです。

さてさて、
先日面白い論文（まだレビュー前）を見つけました。

トランスクリプトーム解析（ゲノムアセンブリではない）で、PacBioとONTのデータを比較した論文です。
オーサーのひとり Dr. Kin Fai Auは ISO-SEQの解析に詳しく、数年前からPacBioを使っています。ロングリードがアイソフォーム解析に有効だということはとても理解しています。

中立な立場で書かれた評価論文なので、どちらにも偏りの無い記述が目立ちます。

ロングリードの欠点は、精度が低い、ということだと彼らはいいます。
確かに、転写産物の１分子を読むには、数十回もカバレッジを重ねられないのである意味当たっています。

このブログを読んでいれば分かるかと思いますが、PacBioには、CCSという同じDNA分子を何度も読むことで精度を上げる方法があります。
１本の転写産物を、何度も繰り返し読んで精度を上げるのです。
また近年では、TofuというIso-Seqの解析アルゴリズムの中で、完全長cDNAを読んだ配列同士でクラスタリングを行い、１本の転写産物をCCSで読む以上にコンセンサス配列の精度を上げる方法も有ります。
ですが、この論文では、わかりやすい CCS で比較をしています。

一方の ONT は、同じDNA分子をポアに２回通す2Dという方法があり、精度は1回しか通さない 1D よりも高いです。1D は、PacBioでいう subread に対応します。
まずはこれがその比較

エラー率に注目！

• PacBio の CCS : 1.72 %
• 対するONT の 2D : 13.40 %
• PacBio の subread : 14.20 %
• 対するONT の 1D : 20.19 %

ONTの精度はもう少し高いと聞いていましたのでびっくりしました。
試薬バージョンによるのでしょうかね。
しかし、2Dが使われなくなるかも（PacBioから特許侵害訴訟を起こされているため）しれませんから、そうすると ONT としては 1D + ショートリード補正、というのが今後の使い方になるのでしょうか？

さて、論文の中に下のような文章があります。

"Results: PacBio shows overall better data quality, while ONT provides a higher yield. As with data quality, PacBio performs marginally better than ONT in most aspects for both long reads only and Hybrid-Seq strategies in transcriptome analysis."

なるほど。
いいんじゃないでしょうか。まだまだ勝ってる（笑）。

PacBioのエラー補正にショートリードを使わなくても良い、と個人的には思いますが、一方のONTをそうやって補正しているので、比較のために同じ条件でエラー補正したんでしょうかね。
PacBioとONTのエラーのパターンなんかも述べられていて、面白いです。
もちろん、転写産物解析にどちらのデータが使えるか、というのもちゃんと比較しています。

論文のリンク、忘れていました。
ここです。　

PAG報告 パート7 最終回 プレゼン録画のお知らせ

国際学会の醍醐味は、海外でどんなことをやっているかを知ることだと思います。

必ずしも最先端とは限らないけれど、日本であまり聞かない話や、逆に日本の研究が世界でこんなつながりがあるんだ、と気づくことがあります、

私自身、国内でも育種学会や、農学中手の会や、アグリゲノム産業研究会などを通じて植物のゲノムを再勉強しています。

そんなこんなでPAGはとても面白い勉強の場でもありました。

さて、今回はPAG報告の最終回。
PacBio関係のセミナープレゼン録画やスライド、ポスターなどの情報がネットにアップされましたのでお知らせします。

ぜひこれを見て、PacBioのSMRT Sequencing がいかにゲノムアセンブリやトランスクリプトーム研究に貢献しているか、を実感して下さい。

尚、上記セミナースピーカーのうち、ErichさんはBird 10K プロジェクトのリーダーで、PacBioのカスタマーイベント（という名の飲み会）で近くのテーブルにいたからしばらく話したひと。
Benさんは、知り合いと待ち合わせていたホテルのバーで偶然隣に座っていて友達になったひと。

こういう出会いも海外学会の醍醐味ですかねえ。

上記のビデオ、プレゼンファイルのダウンロードはこちらから。

コーヒーゲノム

これは私が先月サンディエゴのPAG学会で出会った、とっても元気な日本人からお土産に頂いたコーヒーです。香りが良い！　ありがとうございます。

コーヒーと言えば、世界でもっとも良く飲まれている飲料のひとつでしょう。
私も1日に3杯は飲んでいます。
そんなコーヒー豆のゲノムを読むプロジェクトは、アメリカとヨーロッパで行なわれています。
私が知っているのはネスレが以前、アラビカ豆と何かを読んでいた話。
（すみません、昔どこかでレポートした記憶でしたがすぐに探し切れませんでした）

さて、コーヒーゲノムをPacBioで読んで、品種改良などに役立てようとする試みは、こちらでも紹介されています。

RSII 大活躍 !

PAG報告 パート６ DovetailやNRGeneなど（その２）

前回、NRGeneの話ができなかったので、本日はそれ。
この会社は、イスラエルにあります。
ラボは無く、解析だけを行うドライのスペシャリストの会社です。

彼らのサービスはゲノムアセンブリ。その名も、DeNovoMAGIC
お客さんはアメリカにあるNRGene提携先サービスプロバイダーに、サンプル（組織とか）を送ります。
アメリカでシークエンスをして、データが出たらイスラエルのNRGene社がこれを解析します。

前回紹介したDovetail 社はシカゴライブラリとかHi-Cとか、すごく長い距離をカバーするライブラリ（シカゴの場合は100kb, 200kb それ以上、Hi-Cの場合はMb単位）を作るのに対し、NRGene は他社のライブラリー技術をうまく組み合わせます。
例えば、数種類のペアエンド、数種類（3,000～9,000bp）のメイトペア、そして10X Genomicsの Linked-read，これらをそれぞれゲノムサイズの数十カバレッジかそれ以上読みます。
そしてNRGene独自の解析技術でアセンブルを行ないます。

これは私の主観ですが、DovetailのChicagoやHi-Cは、スキャフォルドをできるだけ長く作るのに優れていて、NRGeneは長さよりもハプロタイプごとのフェージングにより力を入れている気がしました。
あくまで私がPAGでそれぞれの結果の発表を聞いた限りの印象です。

どちらの会社も、「自分たちのほうが精度が高い。アセンブリ結果は良い」と言うので、メーカーの話を鵜呑みにはせずに、ユーザの声を聞いたほうが良いですよね。

但し、Dovetailの技術が論文でも公開されているのに対し、NRGeneのアセンブリ技術はブラックボックスです。
ここを気にするお客さんはいるかもしれません。

PAGではどちらの会社のひとたちとも会って話したり食事もしましたが、どちらも感じ良い雰囲気でした。皆さん楽しんで仕事しているんでしょうね。
社員さんはカリフォルニア（Dovetail）とイスラエル（NRGene）の国民性がはっきり出ていましたよ。

そんなNRGeneですが、日本では代理店がまもなく決まります。
ですのでその会社のビジネスの邪魔にならないよう、これ以上はブログでは控えます。


でも私は断然、Dovetail 押し！
価格もDovetail の方が安いですよ。
Dovetailの方が、アセンブリの経験も多いし、これまで行なった生物種の数も多いし、実験から解析の方法が論文で公開されているし。そういったところが評価されると思います。
PacBioとも相性いいですからね。

PAG報告 パート５ DovetailやNRGeneなど

PAGでのゲノムアセンブリの発表、PacBio、ONT、Illuminaペアエンド/メイトペアなどのシークエンス技術は当たり前として、そのほかにも最近良く話題になっているのは新しいスキャフォルディング。前回はBioNanoを紹介したので今回はこの３つ

• Dovetail Genomics社のChicagoメソッドとHiC
• Phase Genomics社のHiC
• NRGene社のDeNovoMAGIC

Dovetailについては、以前ここでも紹介しましたね。

日本版ウェブサイトはこちらです。FAQあります。

Dovetailは、Chicagoという、In vitroで超長鎖ライブラリを作るテクノロジーが特徴です。
これにより、100kbp、200kbpといったゲノム配列の両端を読んで、Contig配列の向きと並びをそろえ、スキャフォルドします。
In vivoで超長鎖ライブラリを作るテクノロジーには、HiCというものがあり、これは細胞の中で染色体そのものをライブラリ作製の材料に使うので、Mbp単位の配列の両端を読んでContigをスキャフォルドすることができます。
つまり、ChicagoとHiCはスキャフォルドできる長さと精度が違う。
Chicagoの方がHiCに比べて、スキャフォルド長は短いが精度が高い。

きちんとしたガイドラインがあるわけではないですが、

• ContigのN50が数十kbであればChicagoでスキャフォルド
• ContigあるいはScaffoldのN50が数Mbpあれば、HiCでスキャフォルドすれば良い

のではないでしょうか？

Dovetail Chicago の例としてコペンハーゲン大学のダイオオイカゲノムの話がありました。
Cephalopod（頭足類）の動物は意外と種類が多くて、800種ぐらいあるそうですね。
マッコウクジラと戦った形跡（鯨に吸盤がついたままの化石）は残っているそうで。
さて、そんなゲノムを以下のシーケンサーで読んだ

• イルミナ　x72
• 454　x0.1
• Moleculo x1.4
• Dovetail Chicago　x40
• PacBio　x10

アセンブリの結果はこちら
イルミナ　－＞　100万本のContig、N50＝4kb、最大119kb
＋454　－＞　210,624本Contig、まだまだ短いN50
＋Chicago　－＞　7,376本のScaffold、N50＝4.9Mb、最大33.9Mb
＋PacBio　－＞　7,276本のScaffold、N50＝5.5Mb、最大38.3Mb

PacBioを加えてもあまり長くならなかったのは、PacBioのデータはここでは最後に使われたからです。
つまり、Chicagoである程度つながったScaffoldのギャップフィリングに10掛けのPacBioデータが使われたから。

これはXenopusの発表でもあったのですが、Dovetailで作ったScaffoldをPacBioの10掛けデータでギャップフィリング。こういう使い方もあるんだー、って少し目からうろこ。
だって順序が逆ですから。
今まで私が普通に思っていたのは、PacBioでまずx50以上読んで、アセンブルして、長いContigを作った後にDovetailでスキャフォルド、という流れでした。
でもコストの問題で、なかなか大型ゲノムをPacBioだけでアセンブルできない、という場合もありますよね。

さて、これ以上長い、染色体レベルのScaffoldを作るには、HiCが向いています。
HiCの技術は、DovetailでもPhase Genomicsでも受託メニューにあります。

USDAのBen Rosenさんのヤギゲノムアセンブリの発表では、カバレッジは忘れましたが、
PacBioだけ　－＞　3,074本のContig、N50＝3.8Mb
＋HiC　－＞　31本のScaffold、N50＝87Mb

また、森林ゲノムセッションの、Manuka (マヌカ、またはギョユウバイ？という植物)ゲノムアセンブリの発表でも、ショートリードとHiCが使われていました。Dr. David Chagneらは、この300Mbの二倍体植物をまずはショートリードで読み、
1,278本のScaffold、N50＝3.8kb、全体サイズ471Mb（これには植物ライクな配列も含むらしい）
これにPhaseのHiCを加えると、
11本のPseudo-chromosome、N50＝26.3Mb、全体サイズは295Mb
連鎖地図と比べても82％のConcordanceを持っていたらしい。
ちなみにこのマヌカという植物からとれた蜂蜜は高級品らしいです！
プレゼントにどうでしょう？

NRGeneの説明スペースが無くなってしまいました。これは次に。

DovetailのChicago、HiCについては、２月７日の「PacBioセミナー＠秋葉原」で少しご紹介しますね。
では。

PAG報告 パート4 BioNanoでスキャフォルド

ゲノムアセンブリには、PacBioのシークエンスは今や欠かせない、必須の手段と言えるでしょう。
PacBioのシークエンス無しにデノボアセンブリの発表をすると、オーディエンスから「何でPacBioを使わなかったの？」と聞かれる始末。
これはPAGのあるセッションで私が実際に目にした事実です！　
5年前は、精度がどうの言われていたので、それからすると感慨深いなあ。

とは言ってもコストの問題やゲノムサイズの大きさで言うと、PacBioだけのシークエンス＆アセンブリで完結できる生物種は、少なくともPAGに登場する生物の中では少ないようです。
そんなときに使われるのが、最近良く話題になっている新しいスキャフォルドの方法。
今回のPAGで登場したのは

• BioNano Genomics社のIrys
• Dovetail Genomics社のChicagoメソッドとHiC
• Phase Genomics社のHiC
• NRGene社のDeNovoMAGIC

このうちDovetailとNRGeneのセミナーには参加してきました。

上記の前提として、PacBioやショートリードで読んだ配列のContigが既にあります。
そしてこれらのContigの、向きと並びをそろえて真ん中をNで埋める、いわゆるScaffoldを作るのにこれらの技術が使われているのです。

BioNanoのテクノロジーは前も紹介しましたね。
Physical Mappingという技術でゲノム上の特定塩基だけを認識してラベリングし、DNAがナノチェンバーを通過する際に蛍光を検出、特定塩基のあった場所のゲノム上の位置情報を出力します。
100Mb以上の長いきれいな（Nickの無い）ゲノムDNAを用意するのがミソで、これが出来ないと蛍光が間違った場所についてしまい、データがダメになってしまいます。
でもうまくきれいなDNAを取れれば、ゲノムアセンブリの結果がとても向上するみたいです。

Complex Genomeのセッションで、Maize GenomeのB73リファレンスゲノムを作った話の中、PacBioとIrysが使われていました。

• PacBioはP6-C4でx65
• Irysはx60のマップ情報（100kbあたり11マップ）

PacBioデータをFalconでアセンブリしたあと、IrysマップでスキャフォルドしてPseudoChromosomeを作った発表でした。
ちなみにPacBioだけからのContigは、平均して５つのBACクローンの配列をカバーしていたそうです。
PacBioで配列レベルを明らかにし、IrysでContigの向きと順番をそろえたということ。
20本の染色体のうち14本で、180箇所のテロメアリピート領域を配列レベルでしっかり読めたという話でした。これはPacBioがすごかった話。

もうひとつはSolanaceae、ナス科のナス属のアセンブリの話で登場していました。
ショートリードのアセンブリではN50がどうやっても650kbしかいかなかったそうですが、Irysデータを加えたらMbレベルになったそうです。
遺伝子数は、いろんな報告があるそうですが、35,000くらいだそうです。ヒトより多い。
それはそうと、ナス科の植物はやたら種類が多いそうですね。
ジャガイモ、ピーマン、トマト、トウガラシ、タバコ、ホオズキ、そしてナス。

さて次は、Dovetail、HiC、Phase、NRGeneについてです。お楽しみに。