ヒト構造解析とFix-C

前回Hi-Cについて少し触れたので、もうちょっと。
Hi-Cと言えばこれらの論文が有名です。

• Hi-C: Lieberman-Aiden E. et al. (2009) Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science 326: 289-293
• 3-C: Duan Z. et al. (2012) A genome-wide 3C-method for characterizing the three-dimensional architectures of genomes. Methods 58: 277-288

結構前からあるテクノロジーなんですね。

元々は染色体の構造、3次元での構造を解析する技術です。

それをゲノムアセンブリに応用したのが、Chicagoであり、Dovetail Hi-Cであったわけですが、もともとの構造解析という使い方を応用して、「ヒトゲノム構造解析」というのも可能なわけです。

Dovetailのヒトゲノム構造解析サービスは、アメリカではすでに行われています。

この資料はここからダウンロードできます。

実験の原理は、ゲノムアセンブリに使うHi-Cと同じです。

最初のサンプルが血液、細胞、またはFFPEサンプルになります。

ちなみに血液なら2mL 、細胞の場合10の7乗個程度、FFPEは厚さ10μmのスライス、組織の場合は1平方㎝ x 20μmが必要量らしいです。
そこからHi-Cライブラリを作製し、HiSeqを使って2x150PEで150M本読む。

そしてヒトゲノム参照配列にマッピングし、距離の分布図を作る。
染色体レベルの転座や大きな欠損変異などを検出する。
→解析のソフトウェアは、Selvaというものを用いる。

検出できる変異の大きさは、50kb以上です。それ以下だと感度が下がるそうです。
つまり、PacBioとは競合しない！！
PacBioは50bp～50kbくらいまでのInDel検出が得意だけれども、50kb以上の巨大な変異はリードが届かないので検出できない。
Hi-Cは連続配列では無くリードペアで変異を検出するので、あまり小さい変異検出だとノイズと差がはっきりしない。そのかわり、染色体レベルの構造変異検出には強い！

論文もbioRxivですが投稿されていますので、アルゴリズムに興味のあるひとはどうぞ。
検出感度でいうと、FISHと比べてもひけをとらず、例えば12個のがんのFFPEサンプル（20~90％の割合）をHi-C+Selvaで解析し、FISHで検出できた変異とどれくらい合っていたか、を比較したデータがあります。

Dovetailヒト構造解析のProduct Highlightから
ダウンロードできる資料です

ほとんどはFISHの結果と正しく、またサンプル#1や#6は、FISHの方が間違っていたそうです。がん細胞の割合が20%のとき、50kb以上の大きさの構造変異の検出感度は67%です。100%がん細胞のときは検出感度90%だそうです。

そしてこのFFPEからのHi-C、というサービスを行っている会社はほかに無いらしく、Fix-Cという商標をつけています。
FFPEはもともとDNAがフラグメント化しているから、ロングリードには向かないんですよね。

最後に、これは「まだ」受託サービスのみ、の商品なんです。
つまりサンプルをアメリカに送らなければいけない。
アメリカ国内のサンプルなら国内移動で問題無いので結構売れているらしいです

キットやソフトウェアの配布は、今のところ、予定はありません。
そういうニーズが世界的に増えて、キット＆ソフトウェアの配布が可能になればもっと世界に広がる技術だと思うのですが。
とりあえず、海外へ送ってもいいサンプルで、この変異解析に興味がある方は連絡ください。
1サンプル、凄く高めに見積もっても50万円くらいです。
実際は都度見積もりですけれど。

PacBio 解析ウェブセミナーと、Hi-C解析のソフト

先日は秋葉原にて、第4回目となる「PacBio現場の会」を行いました。
事前登録88名、プラス演者の先生方、協賛企業の方々、我々。
部屋のキャパの都合で88名で打ち切ったのですが、もっと大きな部屋を用意すれば良かったかなあ。
情報交換会やその後の有志二次会も楽しかった。

個人的な意見ですが、NGS現場の会の大会が無くなって、NGS関連の情報を総合的に、学術的な枠を超えて、得る場がほぼ無くなったと思います。
植物の研究者、魚類の研究者、微生物の研究者、がんの研究者、遺伝病の研究者、、、。
こういう方々が一同に会す場はなかなか無いですよね。
共通点はゲノム、ということでシークエンサー関連の企業のセミナーが集まりやすいのでしょうね。たいてい無料ですし。

余談ですが、大きな国際学会、例えばアメリカ人類遺伝学会とかでは、企業はブースやセミナーの他に、レストランを貸し切って招待制のディナーや、パーティー（Customer Appreciation Event ）をするんです。
お客さんとのネットワーキングが主目的で、あとは主催企業のプレゼンなどがあります。
こういうの、日本でもできないかなあ。

さてさて、PacBioデータ解析のウェブセミナーが日本にやさしい時間帯で行われます！
深夜じゃないよ！

第一回： 6/7 1PM~ デノボアセンブリ解析のウェブセミナーです
 A Sketch of Assembly Recipes for PacBio Data

第二回： 6/14 1PM~ トランスクリプトーム解析のウェブセミナーです

 Survey the Transcriptome Diversity Using Iso-Seq Analysis

初心者にもわかりやすい内容、と聞いていますので、これから始めるひとにも良いかと思います。

さてさて、今日お知らせしたいのはもうひとつ。
PacBioのデータのアセンブリと言えばFalcon＋Unzipですよねー？
Hi-Cデータというのは、Dovetail Genomicsでも行っているあの、染色体レベルでスキャフォルディングをするデータです。
最近ではここのPAG報告で紹介しました。
Hi-Cについては遺伝研の東先生のこのスライドがとても良くまとまっていると思います。

このHi-Cデータを使ってPacBioのアセンブリ結果からスキャフォルディングするアルゴリズムの論文が出ました！

FALCON-Phase: Integrating PacBio and Hi-C data for phased diploid genomes

PacBioデータとHi-Cデータが手元にあって、アセンブリに興味のあるひとは使ってみたらいかがでしょうか？

Sequel を爆買いする中国の勢いが止まらない（ジョークです）

注：ジョークです　エイプリルフールネタにしようと思っていた
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中国では、Novogene社やAnnoroad社がSequelを10台単位で購入しているそうで、その爆買いぶりに開いた口が塞がらない。
そんな中、PacBio本社では、これからさらに来るであろう注文を見越して生産態勢を一層強化したそうです。

それがこの写真！

生産が完了したSequelたち

日本含むアジアに向けてまもなく出荷予定のSequelたち

積み出しを待つSequelたち

こちらは欧米向け出荷予定のSequelたち

これちょっと並び方がおかしい？　それは真上から撮影したらわかります。

すみません、全体を写すとこうなります

遊び心がありますねー。

NGSの装置で会社のロゴを作ってしまうとは！！

ゴールデンウィーク中日ですからこういう軽いネタで許してください

はい、もちろんこれは本物の装置ではありません。USBです。

欲しいかたは↓こちらの会に参加してGET！　数に限りがあるので早いもの勝ち

5月18日「PacBio現場の会 2018」

登録はこちらから

まだ若干席がありますよ！

Genetics and Genomicsっていう夜中のバーチャルイベント

ゴールデンウイークですが、皆さんはいかがお過ごしでしょうか。
帰省？　旅行？　それとも仕事？
私は家でのんびり、というわけにもいかず、初日は人間ドックでした。
直ぐわかる範囲では検査結果に異常は無く、若干白血球が低め、みたいなことを言われましたが気にするほどでは無いとのこと。
そんなわけでこんな時間（夜中）ですがパソコンに向かっています。　

LabRoots.comが提供するバーチャルイベント、Genetics and Genomicsが再来週の5月9と10日にあるそうです。
PacBioを使ったメタゲノムの話が2つあるみたいなので、紹介しますね。

先ずは我らがCSOの話。ショットガンメタゲノムのお話も出てくるそうです。

こちらはrRNAのPCRアンプリコンで株レベルまでの微生物プロファイルをした話。

と、以上の２つがPacBio社からお知らせメールで回って来たのですが、いかんせん、時差がキツイ！
向こうの朝9時って日本の翌深夜1時なんですよねー。
1時に難しい話を英語でされて、寝落ちしない自信が無い・・・

私的には、以下の構造解析、NGMLRとSniffle の開発者の話も聞きたいけれどこれも深夜1時、ガクっ。
でもPacBioやNanoporeのデータを使って、さらに10Xのリンクドリードも使って、染色体構造解析をするあたり、やっぱり1時過ぎまで起きて聞きたいなあ。と思ってみたり。

リンク先はこちらです
興味のあるかたは、頑張って起きてみてください
夜中のイベント、っていうと楽しく聞こえるけど、ね。

--------- 5/18（金）は秋葉原へ集合！------------

「PacBio 現場の会 2018」

登録はこちらから

5名の招待演者と

PacBio、Dovetail、その他最新NGS情報を

一度に聞ける年に一度のイベントです！

情報交換会もあります。

参加無料　空席あと少し、急げ‼

ローディングリコメンデーションという「推奨」

PacBioに限らず、ローディングリコメンデーションという単語があります。
アプライDNA量の推奨値、という方がわかりやすいでしょうか。
シークエンスデータが最も最適に出力されるような、DNAライブラリの濃度と量のことを示しています。

「最適に出力」という意味は「より長いリードをより多く出力」と考えてかまいません。

その前に、、、
P0、P1、P2、というPacBioに特別な単語があります。
これはZMWの中にポリメラーゼとSMRT Bellライブラリのコンプレックスが入ってシークエンスされるわけですが、そのデータを見て、

• P0：データ無し→つまりZMWにライブラリが入っていない。空っぽ
• P1：きれいな１分子のDNAデータが出てくる→きちんとZMWにライブラリが入って、かつシークエンスがされていた
• P2：上記以外→データがノイズばかりの場合。ZMWに複数ライブラリが入った場合。クオリティが低いリードしか読まれていない場合など

を区別しています。

実際解析に使用されるデータは、P1のデータです。

アプライDNA量が極端に少なければ、ZMWに入るライブラリが少ししかないのでP0が増えます。逆に極端に多くライブラリを入れた場合は、オーバーロードと言って、P0は減るかもしれませんがP2が増えることが予想されます。

RSIIや初期のSequelの場合、ZMW全体のうち20%～40%のZMWからP1データが出力されることが望ましい、と言われていました。

ポワソン分布に従うならば33%、それをもっと上げるためにマグビーズなどが使用されて40%、多い時は50%を目指していました。

Sequelの5.1になり、そのリコメンデーションが改訂されました。ここ

• P1はほとんどのアプリケーションで50%以上を目指すように
  （ただし、あまり多くのP1リードを目指すとリード長が短くなる恐れもある）
• オーバーロード（ライブラリの入れすぎ）の指標は、P0の値を参考にする。P0は20％くらいが望ましく、10%を切るようならばライブラリ量を減らした方が良い
• Iso-Seqやアンプリコンの場合、Pre-extension（読む前にシークエンス反応をある程度進める方法）をするので、P1は70%を目指すことが可能で、P2は20%未満を狙う
• Expressキットを使うゲノムアセンブリ用のロングライブラリの場合、P1は50%台を目指す
• バクテリアのマルチプレックスは、P1は50～65％を狙う

と、細かいことですがつまり長いライブラリでもZMWの半分からは良いデータが出てくるような濃度でアプライすることを推奨しているのですね。

SequelセルのZMWは100万あるので、50万本のロングリードが1セルから出力されることを想定して、最適なライブラリ濃度を調整することが必要というわけです。

短めのライブラリ、Iso-Seqやアンプリコンの場合は、最高70万本の配列が出力されることが十分あり得るのでデータ単位のコストはかなり低くなると思います。

ここまで書きまして思うところがあるのですが、

P1の数字を狙って濃度調整することは難しい！

というのがユーザの本音だと思います。

なのであくまでもリコメンデーション、推奨、なのです。

「その値を狙ってアプライしたときが一番良い結果を生むと思います。ですが結果はサンプルにも依存するので必ず良い出力を出すという保証はございません」

という意味です。

なので受託に頼んでスループットが予想ほど良く無くても、受託会社さんを責めないでくださいね。

ハイブリッド でIso-Seqしたい方はこの論文を！

Iso-Seqは皆さんご存じですね。
PacBioのロングリードで完全長cDNAを一気に読んで、スプライシングバリアントを含めたRNAの構造解析をする方法です。

ショートリードでデノボで転写産物をシークエンス＆アセンブリする方法には、Trinityという有名なものがあります。
しかしリピート配列があると正確に転写産物を再現できない、K-merサイズによってはアセンブリが不正確になる、など、ショートリードだけの完全長cDNAシークエンスには限界がありました。

IDP-denovo

そんな中、ショートリードでデノボアセンブリしたアイソフォームコンティグに、ロングリード配列をマッピングさせて、アイソフォーム全体の姿を再現するIDP-denovoというツールが出ました。

この論文はあくまでも、ショートリードがメインで、これを補佐する役割としてPacBioのロングリードが登場します。
正直、私はPacBio一本でやった方が良い気がしたのですが、、、。
だって最初のショートリードのアセンブルで、既に、読める配列がイルミナ技術に依存しているでしょう？
それからPacBioで一分子配列を付け足して補正、ってどれだけ精度が上がるのか疑問。

多分、コストが問題だったのでしょう。
でも今はSequel使えばコスト的にもだいぶ割安感があると思うんですけどね。



さてさて、ここからはIso-Seqの話です。
SMRT Link（PacBio解析ソフトウェア）バージョン5.1には、Iso-SeqとIso-Seq2が搭載されています。
へぇ、Iso-Seq2とは？

その前にIso-Seq解析のおさらいです。
実験のプロトコルはこちらからダウンロードできる。簡単に言うと、

1. サンプルの中で発現しているmRNAの、完全長cDNAを作る
2. 完全長cDNAをPCRで十分量増やす
3. SMRT Bellライブラリを作る（SequelではIso-Seqのサイズ分割は基本行わない。長い転写産物に注目したい場合は4kbを境に分割しても良い）
4. Sequelで読む→　データが出てくる

ここから先は、SMRT Link 5.1で解析すると仮定しますね。

Iso-Seq解析は最初にCCSを作ります。

5'プライマー、インサート配列、ポリA配列、3'プライマーを持つ場合、完全長cDNAとみなされます。完全長＝Full Length（FL）と不完全長＝Non-FLのリードに分ける。
このステップがClassify

次のステップがClustering
アイソフォームレベルのクラスタリングを行うにはFLのCCSだけが使われる。
このクラスタリングステップがとても時間がかかり、今まで問題になっていた。
Iso-Seq1では配列の長さが同じくらいのものをまとめ、クラスタリングを行っている。
Iso-Seq2では塩基配列のパターンから同じようなものをまとめ、クラスタリングを行っている。

2の方が1より2倍ほど計算速度が速いとのこと。

さて、クラスタリングしてアイソフォーム配列が出来たら、これにFLとNon-FLのサブリードをアラインし、ArrowまたはQuiverで配列精度を高める。
いずれにしても、転写産物を網羅的に見る場合は、Iso-Seq2の方が良い。
一方、ターゲットIso-Seqの場合は、どのアイソフォームも同じような配列パターンを持つので、サイズによってクラスタリングする普通のIso-Seqの方が良い。

最後に、リファレンスがある場合はGMAPでゲノム配列にマップして、Alternative Splicingを見る。ここはヒトとかマウスとかのモデル生物で行われる。

アイソフォームを見つけたらその精査が必要だ。

SQANTIというツールは見つけたアイソフォーム配列を、機能ごとにアノテーション付けてくれる。
FSM = full splice match   (perfect match w/ known isoform)
ISM = incomplete splice match  (partial match)
NIC = novel in catalog  (novel isoform with known junctions)
NNC = novel not in catalog  (novel isoform with new junctions)
というように。
論文にもなっているのでこちらもどうぞ

そのほかにもありますが今日のところはこれにて

5月18日（金）は秋葉原にて「PacBio現場の会 2018」

登録はこちらから！

ーー＞　http://bit.ly/2GkoGjS

ロングリード解析やっているひとはこの論文を絶対読まないと！

NGS解析をやっているひと、特にロングリード解析をやっているひとは絶対読まなければいけない論文、それがこれ
Piercing the dark matter: bioinformatics of long-range sequencing and mapping
Sedlazeck et al., （2018）Nature Reviews Genetics.

ロングレンジ技術を使ったゲノム解析に関する、すごくComprehensiveにまとめられた、バイオインフォマティクスのレビューです。
これはほんと超おすすめ。
このレビューはいくつかのパートに分かれてまして、

１．ロングリードテクノロジーのまとめ
ここでいうロングレンジ技術とは、Pacific Biosciences (PacBio)や Oxford Nanopore Technologies (ONT)のように、「本当の」ロングリードと、10X Genoimics のリンクドリード、BioNanoのフィジカルマッピング、Hi-Cのような超ロングレンジメイトぺア、を含みます。
それぞれの技術の特徴（ロングリードのエラー率の高さなど）がまとめられています。
Bamファイルの今のフォーマットが、ロングリードマッピングデータにはもはや向いていない、という点は前から言われていましたね

２．De Novo Assemblyへの挑戦

• ゲノムに存在するリピート配列の存在が、ショートリードでのゲノムアセンブリを難しくしている
• ロングリードが30カバレッジ未満しか無いときは、ショートリードとのハイブリッドを使うべきだろう
• しかしショートリードでのロングリードエラー補正（PBcR, Nanocorr, Spades and MaSuRCA,）は、GCバイアスなどの問題でロングリードを正しくエラー補正できない可能性がある
• ロングリード同士のSelf Correction (HGAP, PBcR, Canu, MARVEL or FALCON）が、もっとも良い
• 倍数性の高いゲノムのアセンブルは今も、難しい (NRGeneという会社は倍数体があっても独自の秘密プログラムで行っているそうですが仕組みは非公開です)
• コンティグを作った後のポリッシングには、QuiverやArrow（PacBio用）、Nonopolish（ONT用）、Pilon（ショートリードをポリッシングに使用）などがある

３．スキャフォルディングとギャップフィリング

• スキャフォルディングには、10XやHi-Cなどが有効
• しかしアセンブルの時点で高精度のコンティグを作ることが何より重要

４．SV解析

• まずはSVの定義をはっきりさせている（挿入とか欠損とか、転移とか）
• SV検出精度はマッピングの精度に依存する（BLASR, BWA-MEM, minimap/minimap2, LASTなどについても言及）
• コスト、倍数体、リファレンス配列の精度、などがSV解析の大きな問題点

そのほか、ここには書ききれないほどのトピックスがたくさんあって、とにかく、一度読んでみてくださいと言うしかない！

バイオインフォマティクスのレビューなので、アセンブルからSVコール、RNAシークエンスまで、巷にあふれるたくさんのツールの解説があります。

もちろんこのレビューは、決してPacBio贔屓ではありません。

ロングリードはPacBioとONTがありますが、むしろ、最長ロングリードはONTに軍配が上がっている。

PacBioは、エラーのランダム性から、コンセンサス配列の精度は最も高いロングリードと言える。

どうやってもロングリードの場合、PacBioもONTもリード長には限界があり、結果、10XとかHi-Cとか、ショートリードによる擬似的な超ロングリードとの組み合わせがアセンブル結果や構造解析、フェージング解析の結果を大きく改善することは間違いない。

今の時代、複数のテクノロジーを、最適なバイオインフォマティクスツールをうまく使いこなして解析することが重要なんだなと、改めて実感するレビュー論文でした。

--------- 5/18（金）は秋葉原へ集合！------------

「PacBio 現場の会 2018」

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