ハイブリッドアセンブリ 悩みどころとそのヒント

リオオリンピック、日本選手の活躍が目立っていますね。
ところで皆さんはどの競技が好きですか？　水泳？マラソン？陸上？

私はやっぱり陸上ですね。
ボルトの100mもすごかったですが、見入ってしまうのは普段あまり目にしない、ハンマー投げとか、円盤投げとか、3000m障害とかですよ。
投げ系は単純に飛距離を競うところがわかりやすいし、投げた後の雄たけびで、こっちも力が入る。
障害はもはや、何でもありでしょう。飛んだり跳ねたり、水辺に入ったり、誰がこんなルール作ったのか。
最初はみんな一緒にスタートするのに、途中で離されたり、転んだり、抜き返したり、ドラマがありますね。

さて、ドラマがあるといえば「ハイブリッドアセンブリ」
使うツールとデータ量のサジ加減で結果がずいぶん違ってくる＝ドラマがある


ハイブリッドアセンブリとは、異なる技術のシークエンサーデータを組み合わせてアセンブルすることです。
7年前くらいは、ハイブリッドといえば、数十bpのイルミナリードと、数百bpの454リードを合わせてアセンブルする、ということを良く聞きました、が、
PacBioの登場で、ハイブリッドアセンブリは大きく2つの意味に分かれました

1. PacBioロングリードを、イルミナショートリードでエラー補正してからアセンブリする（2012年ごろ登場したPacBioToCA, ECToolsでは主にこの意味）
2. イルミナショートリードで作ったContigを、PacBioロングリードでScaffoldする（2013年ごろのPBJellyの登場からはこの意味も加わる）

厳密には、2はアセンブリというよりScaffoldingですが、これもハイブリッドアセンブリと呼ばれることが多いです。
ちなみに研究者のひとと話をするとき、どちらの意味でハイブリッドと呼んでいるのか、最初に確認するようにします。でないと、話がすれ違いになってしまう！

では、最近多い、2の意味でハイブリッドアセンブルするとして、どのデータをどれくらい用意して、どのツールでアセンブルしたら良いのでしょうね？

で、ちょうど良い論文があります！

Chakraborty et al., (2016) Contiguous and accurate de novo assembly of metazoan genomes with modest long read coverage. Nucl. Acids Res. 

この論文は、PacBioリードのアセンブリ戦略をこれから検討するかたに、いくつかヒントを与えてくれます。
彼らはショウジョウバエのゲノムをサンプルにして、PacBioとイルミナのシークエンスをおのおのどの程度（ゲノムカバレッジ）読んで、どのツールで解析すれば良い結果（ContiguityやCompleteness）を得られるか調べています。

ハイブリッドアセンブリの方は、いろいろ試した結果、DBG2OLCを採用。
Platanusを使って67.4xのイルミナデータ（DPGPプロジェクトデータを拝借）をアセンブリし、そのContigとPacBioロングリード（様々なカバレッジ量）をハイブリッドアセンブリするパイプライン。

比較としてPacBioのみのアセンブリは、PBcRを採用（注：いまはCanuというツールになっています）

ま、詳しくは論文を参照して頂くとして、ネタばれします。（先入観持たずに論文読みたいひとはここから先は読まないで）

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M＆Mの最初に、ショウジョウバエのゲノムを抽出して、サイズセレクションして・・・って書いてあるけど、シークエンスしたデータはこのアセンブル解析には使っていない、ってはっきり書いてある！　え？
全ての解析データはpublicly availableのものだって!?
ま、それはみんなが試せるから良いとして、ここはスルー

NG50のグラフ（論文中Fig 5）を見ると、PacBioリード40x、53xまでは、ハイブリッドアセンブリの結果の方がNG50が長い（下のほうの3本はハイブリッド、真ん中の青はPacオンリー、一番上の赤線は両方のマージ）
でもその上、62x、77x、99x、121xのPacBioリードでアセンブリすると、NG50は一気に長くなる！

Chakraborty et al.　Fig 5

だからPacデータを使うなら、Pacオンリーデータでアセンブリしたほうが良い！

と、言ってもやっぱりハイブリッドは、需要があるわけです。
理由はコストとサンプル量の制限です。

ほぼ無制限に予算があって、ほぼ無制限にDNAが取れれば、Pacだけでアセンブリしたほうが良いに決まってますが、普通そうはいかない。
この論文でも言っていますが、PacBioを30x程度と、イルミナを70x程度用意できれば、そこそこリーズナブルな結果は得られるでしょう。
この論文の例では、Pacデータ30xと、イルミナデータ70xのハイブリッドの結果のNG50は、Pacオンリーの50xアセンブリのときより長かった、そうです。
もちろんゲノムの複雑さによっては、Pacデータは30xでは足りない、なんてこともあるでしょうが、最初のステップとして、30xはお勧めできます（10xは少ないだろうなあ）。

最後に、必要DNAですが、これは結構盲点かもしれませんね。
マイクログラムオーダーのゲノムDNAを用意して、ようやく数個のSMRT Cellを流せるのですから。必要カバレッジのデータ量を得るために、どれくらいのゲノムDNAを抽出する必要があるのか、これを逆算したら結構な量になるかもしれません。
抽出できるDNA量から、カバレッジの限界を計算して、ハイブリッドを選択するケースもあると思います。

バクテリアのIsoSeqをするには？

今日はバクテリアのIso-Seqの話です。
そもそもイントロンが無いバクテリアの転写産物ですが、完全長で読む意義はあります、よね。完全長で読みたい、というニーズはあったようです。

ではどうするか？
CDNAを作る逆転写には、タカラクローンテック社の SMARTer PCR cDNA Synthesis kit を使います。
でもこの逆転写反応には、PolyA-Tail 配列があることが必要です。
しかしバクテリアのmRNAには、PolyA-tail 配列が無い！

そこで最初に、mRNAの3'側に、酵素反応で強制的にPolyA-tail 配列をつけてしまいます。
Epicentre PolyA Polymerase Tailing Kit

しかしこの反応は、rRNAに対しても PolyA-Tail を付加してしまうので、この後 rRNAを除去することが必要です。
Thermo Fisher RiboMinus

流れとしてはこんな感じ

二重鎖 cDNA が得られたら、PCR増幅して、サイズセレクションして、SMRT Bell ライブラリ作って、RSIIでシークエンス

SMRT bell作る前処理の、rRNA probe とのハイブリ効率はどれくらいなんでしょう？
ここでちゃんとrRNAを除いておかないといけませんね。

プロトコルは、Unsupported　つまり、サポート対象外ですが、興味のあるかたはここからご覧下さい

CCSでアセンブリも、あり！

毎日暑いですね。
そんな時はアイスかかき氷！
私は普段、冷たいものはあまり食べないですが、こうも毎日暑いと食べたくなりますよ。

「黒糖ぜんざい」
沖縄で食べたかきごおりです。ぜんざい、と呼ぶそうですが。
これはおいしかった。


さて、PacBioでのゲノムアセンブリといえば、ロングリード（CLR）を互いにエラーコレクションして行なうのが「定説」と思っている方も多いと思います。
CCSというのは、Circular Consensus Sequenceの略で、比較的短いライブラリを何度も読んで、1分子のDNAの精度を高めていく方法。

何回も同じDNAを読むことで、出力された配列のコンセンサス配列（1分子DNA由来）を、99%以上に高めることができるのです。
今の試薬P6-C4なら、5パス以上で99%の精度に達することも可能です。

ライブラリの長さにもよりますが、1kbから2kbなら、十分精度の高いリード（CCS）を出力することも可能で、それを使ってアセンブリを行なった論文がこちら

8個のSMRT Cell から得られた平均 1,319 bp、99.7%の精度（平均10パス）、94 Mb分のCCSを使って、アセンブリ。
アセンブラーは、MIRA 4.0

この論文はメタゲノムなので、完全ゲノム配列を作るのが目的ではありません。
マーカー遺伝子が読めていればOK
Phylotype Specific な配列データベースを作成するには、どんな配列もバイアス無く読めるPacBioが最適というわけです。

CCSを使った、アセンブリの論文でした。

パイナップルドラフトゲノム PacBioでアセンブリ

皆さん、パイナップルって、よく食べます？（私はたまーにしか食べません）
日本では、リンゴやブドウほどメジャーではないせいか、パイナップルの品種名って、あまり知らないですよね。
八百屋やスーパーでも、普通に「パイナップル」だったりするし。

恥ずかしながら、今日まで、パイナップルにたくさんの種類があるなんて気にしたこともありませんでした。

サイトはこちら

世界で一番多く栽培されているのが、Smooth Cayenne（スムース・カイエン）種だそうです。
でも今、MD-2、別名ゴールデン・パイナップル、スーパー･スイート、などと呼ばれている品種が次々と栽培されているらしい。

時は1961年、ドール社、デルモンテ社、マウイ・パイナップル・カンパニーの出資によって、ハワイ州に、Pineapple Research Institute（PRI）が設立されました。
そこで品種改良によって生まれたのが、このMD-2品種。MDの名は、パイナップル・カンパニーのゼネラルマネージャーの妻の名前、Millie Dillardさんに由来するそうです。
（以上、UTAR AGRICULTURE SCIENCE JOURNAL ● VOL. 1 NO. 4. OCTOBER 2015からの情報でした）

パイナップルって、今まで考えたことなかったのですが、受粉しなくても果実を作るそうですね。
Parthenocarpy（単為結果）と呼ぶそうです。バナナと同じ。
そして、non-climacteric　な植物。
これは、果実を収穫してからエチレンガスをほとんどあるいは全く出さないので、収穫後に果実が熟すことはないらしい。ここのサイトが詳しい。
そういえば、収穫後にエチレンガスを噴霧して、食べ頃をコントロールする話は、昔聞いたことがありました

そんなパイナップルですが、MD-2のドラフトゲノムが論文になりました。

Redwan et al,. (2016) DNA Research

Biotechnology Research Institute, University Malaysia Sabah の、Dr.Redwan らの仕事です
PacBioを使ったアセンブリプロジェクトです。
ここではイルミナリードも使われていますが、目的はPacリードのエラー補正と、Pacアセンブリ後のContigの、Scaffoldingのみです。

先ず、イルミナライブラリ用に350bpと550bpのインサートを作り、HiSeqを使って100bpのシングルまたはペアエンドシークエンス。
さらに、750bpのインサートをMiSeqを使って300bpのヘアエンドシークエンス。
Q20のクオリティ、最低50bpのリードを解析に使用して、154.7カバレッジのデータ量を得た。

PacBioは20kbライブラリ、P4-C2、P5-C3で32セルシークエンス。
フィルタリング後の11.78Gbデータを、イルミナの350pb、750bpライブラリデータで補正。
これには、novoLR package（Novocraft ソフトウェア）を使用。

補正後のデータは8.34Gb（15.9 x）になったので、これをCelera Assemblerにかけてアセンブリ　→　N50 =　25,277bp

Contigの冗長性を除くため、25,000bp以下の短いContigをそれ以上の長いContigにマップして80％以上のContigを除いたり、エラー補正後のリードをContig配列にマップしたりして16％冗長配列を除いている。
このような努力の結果、トータルのContigサイズは想定ゲノムサイズの 96.6% の 508 Mb、N50 は34,762 bpになった。

このようにして作られたContigは、次にイルミナリード、補正前のPacBioリードを利用して、novoLRpolishというソフトでScaffoldingし、N50 が153,084bp、最大Scaffoldが1.29Mbになり、トータル塩基数は524Mbpになった。

アセンブル後のゲノム配列の評価には、CEGMA（Core Eukaryotic Genes Mapping Approach）というツールを使っている。
簡単に言うと、真核生物に存在するコアな遺伝子たちがちゃんと読めているか、を評価するデータツールです。
しかし、残念ながら、CEGMAは昨年サービスを中止したらしいです。
これからはBUSCO（Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs)らしいです。



さてさて、もうひとつ今日驚いたこと。
パイナップルの果肉は、果実じゃない！

ちなみにパイナップルを使った料理のレシピは、クックパッドによれば、現在6,000種類以上もあります！！
こちらも驚き！

Iso-Seq アイソフォームシークエンスアップデート 植物

早いものでもう7月！
あー、もう今年も後半戦になっちゃったー。
7月が終われば夏休みの8月、それが終われば超忙しい学会シーズンの9月、10月。
11月になったらもう分生で、あっという間に12月で師走。
何でしょうね、歳を取ると月日が経つのが早く感じるって言いますね。


さて、アイソフォームシークエンス（Iso-Seq）で最近Nature Communicationから論文が出ました。
Iso-Seqといえば、PacBioのロングリードが活かせるアプリケーションのひとつ、完全長cDNAシークエンスです。
これは前にもいろいろ書きましたが、いわゆるAlternative Splicingを含むmRNAの構造変異が、連続配列として観測できる実験方法です。

これはとうもろこし
論文リンクはこちら

」

そしてこれはソルガムキビ
論文リンクはこちら

どちらも植物ですね。

とうもろこしの方は、6種類の組織から読まれた111,151種類のRNA転写産物のうち、57%はこれまで知られていなかったらしいです！！
とうもろこしといえばアメリカの主要な農作物。
もうとっくに研究し尽くされていて当然と思っていましたが、そうではなかったんですね。

ソルガムキビ、私もよく知らない植物ですが、この論文のすごいのは、彼ら独自で解析パイプラインを作ったこと。
Transcriptome Analysis Pipeline for Isoform Sequencing（TAPIS）というツールは、リファレンス配列にクオリティをパスしたCCSをGMAPでマッピングした後、リファレンス配列を使ってエラーコレクションをするらしいです。

ソルガムキビの論文より引用

これは新たな方法ですね。

9月24日（土）、鳥取大学にて、育種学会があります。
私はその中のセッションにて、Iso-Seqについて話す予定です。
このように新たな論文が次々に出てくるのはうれしいですね。フォローアップをちゃんとしなきゃ。

その他、Iso-Seqの論文をまとめたサイトはこちらにあります！
Pacの社員、リーズさん（かわいい台湾出身の女性インフォマティシャン）がまとめてくれました。
参考になると思います。

Mini-chromosomeで400Mbも？ ジカウイルスの宿主株ゲノム公開

VectorBase Aag2

ジカウイルスやデングウイルスなどの宿主といえば？　　答え　 Aedes aegypti　

これを聞いて「ネッタイシマカ」とわかるあなたは、専門家です！

この Aedes aegypti 株のゲノム配列のアップデート版が、先日公開されました。

VectorBase Aag2

UC San Francisco とPacBioの共同で、この株Aag2を、~58xショットガンシークエンスし、Falconでアセンブリ（これはFalcon 開発者のDr. Jason Chinが、先月自慢げに話してくれたのを覚えています。彼はとってもいい奴です） 。

アセンブリの後は、Quiverを使って生リードを再度Contigにマッピングして、精度を高めたコンセンサス配列を作った。

アセンブルの結果は 3,752本のContig、トータルで 1.72 Gb

Contig N50 = 1.42 Mb

染色体のサイズはBroad Institute とTIGRのグループが別の株でアセンブリした、Liverpoolアセンブリより、400Mb以上も大きかった模様で、これはAag2株の、mini-chromosome の獲得によるものかも知れない、と書いてあります。

私はむしろ、株によって400Mb もゲノムサイズが違うということに驚いているのですが、その理由がmini-chromosomeの獲得、というのにも驚いています。

昆虫の世界、あるいは細胞株の世界では、400Mbぶんものゲノムがmini-chromosome

によってホストに獲得されることって、普通にあることなんでしょうか？

植物ではよくあることかもしれませんが、昆虫でも？

もし本当なら驚きです。

データが公開されたことで、この400Mbがどこから来たものかが、そのうちはっきりされるでしょう。　楽しみです。

（このニュースは、PacBioブログでも書かれています）

mini-chromosomeとは、もともとの染色体から、Origin of Replication、Centromeres、Telomeres、それと遺伝情報の一部、がセットになって分離したもの。

それ自体が染色体のように、細胞内で他の染色体と一緒に分裂して増えていくもの。

です。

第4回アジア・ユーザーミーティング

今年も6月8日～10日まで、シンガポールのGrand Copthorne Waterfront Hotelにて、PAG Asiaが終わったタイミングでPacBio Asiaユーザグループミーティングが開催されました。

毎年参加者が増えて、今回は160人余り。
日本からも8名ほどが参加されました。

今回は第4回ですが、第1回から参加していると、明らかに発表の内容が変わってきているのがわかります。
例えば第1回は、これからどんなことをやっていくか、といったビジョンの紹介と、RSを使って読んでみたデータの紹介がメイン。
まだこれから、という感じはしましたが、少人数のアットホームなユーザーミーティングでした。

第2回からは、いよいよ本格的なアセンブリ結果の発表がメインになってきます。
とはいってもアジアはまだバクテリアゲノムのプロジェクトが多く、大量にセルを流して大型ゲノムに挑戦というのはこれからのような感じでした。

第3回になると、アジアからも真核生物はじめ、大型ゲノムのデノボアセンブリの発表が増えてきます。
サンプルプレップやデータ解析のスポンサー企業からの発表も目立ち始めます。

そして今回の第4回、バクテリアからウイルス、HLA、植物や魚類、哺乳類ゲノムまで、幅広いテーマの発表が相次ぎました。

「PacBioで読んでアセンブルをすると、ショートリードで行なうよりも圧倒的に長い配列（Contig配列）が得られる」
というのは毎度毎度で聞き飽きたかと思いますが、PacBioのユーザミーティングなので、こういう話は良く出てきます。
でも今回はいままでよりちょっと変わってきたかなあ、という印象を持ちました。

大型ゲノムのアセンブリの場合、例えば3Gb程度の哺乳類を、PacBio で読んたとします。
平均リード長＝12kb、サブリードでは125x のデータが得られた。
これをCanuまたはFalconでアセンブリしても、Contig数はそれぞれ3160本、4912本。
Contig N50 は、9.6 Mbp

これだけでも十分すごいんですが、数千本のContigをもっと減らすには、やっぱりScaffolding技術が必要になってくると思います。
前回紹介した、Dovetail社の技術も、こういうときにつかわれていました。
Scaffoldは、10X Genomics のところでも書きましたが、Contig（連続配列）ではありません。
Contigの並びをそろえる、順番を決める、というような目的に使われます。
Dovetail以外にも、BioNanoのPhysical Mappingも使われていました。
そんなふうに、大型ゲノムのアセンブリプロジェクトは、

1. PacBioで50x以上読んでFalconアセンブリして、超長いContigを作る
2. DovetailやBioNanoでScaffoldingする

というのが、（今回のユーザーミーティングを見た限りでは）、今後デフォルトになる気がしました。

ところで今年のシンガポールは、例年より蒸し暑かった。

特にユーザーミーティング期間中は夜も暑くて、日本人の方にはこたえたでしょう。

でも、金曜の夜は涼しくなったんですよ。1日ずれてくれたら良かったのに！