PacBioとナノポア 違いはここだ！ （2017年版）

2017年は、PacBioにとってのライバル、オックスフォード・ナノポアテクノロジーズ（以下ONT）がいよいよ本格的に市場に登場、ロングリード業界に新たな風が生まれました。

（正確には、2016年でもMinIONを購入することはできましたが、誰でも手軽に買えるようになったという意味では2017年が国内リリースの年といっても良いでしょう）

そこで聞くのが、PacBioより長いリードが出てくるとか、バクテリアアセンブリにはONTだけで十分とか、ロングリードはナノポアに席巻されるのでは？という、PacBioに否定的な意見。
一方、ナノポアのデータはまだ精度が悪い、超ロングリードはエラーだらけ、ノートPCではランはできるけど解析はできない、というONTに否定的な意見も。

どちらもロングリードを謳っているだけあって、目的がデノボアセンブリやゲノム構造変異解析、16S解析など、ガチでぶつかるのは当たり前です。
では2017年11月の現時点で、このふたつの製品はどこがどう違うのか？

注！：皆さんご存じ、私はPacBio側の人間なので、これから書くことは多少ともPacBioバイアスがかかっています。そこを承知の上、お進みくださいね。

さて、PacBioとONT、現時点でどこがどう違うのか？

【テクノロジーの違い】単純にいうと

• PacBio：DNAポリメラーゼがDNAを合成するときに、取り込む塩基に付加されている蛍光を、レーザーによって1塩基ずつ検出する。1つのウェルからは1本の配列データしか出力されない
• ONT：DNAがナノサイズの穴を通るときに生じるわずかな電位差を検出し、アルゴリズムが塩基配列に変換する。1つのポアから複数本の配列データが出力される

つまり、

• PacBio：DNA合成を伴う、蛍光色素を使う。レーザー励起エネルギー検出
• ONT：DNA合成は行わない、蛍光色素は使わない。電位差検出

皆さんご存じの方も多いと思います。

【リード長はどうか？】

• 平均リード長：PacBioもONTも同じくらい　（10kb～20kb）
• 最大リード長：PacBioは読むライブラリのサイズ、ムービー時間などで制限されるので60kb～100kb程度ではないかと思う。数百kbのリードは見たことが無い。一方ONTは、ポアを通るDNAが長ければ、最大1Mbのリードも出るそうだ
• しかしリードの本数や分布には注意が必要。PacBioもONTも、短い（とはいっても数キロbpはあるが）リードは多く出力され、長いリードほど出力数は少なくなる。先のONTの超ロングリードも、出力本数でいうと数本
• 因みにランタイムはPacBioのSequelが30分～10時間、ONTのMinIONが1分～48時間、だそうで。

数値についてはこちらを参照（オフィシャルな情報です）

PacBio

ONT

で、精度はどうか？

生リードとコンセンサスリードで精度の意味は違う。

ここを一緒にして、「ロングリードは精度が悪い」という研究者のなんと多いことか！！

【生リードの精度】

• PacBio：RSIIのP6C4ケミストリーや今のSequelは、平均86%
• ONT：精度の数字はケミストリーのバージョンによって様々のようだけど、R9.2は平均80%～85%くらいか（違ってたらゴメン）。でも使うベースコーラーによって精度は変わってくるそうです。ベースコーラーは何種類かある

つまり、どちらも生リードの精度はほぼ同じ、ということになる。しかしもっと重要な点は、エラーの入り方。

【エラーの入り方】

• PacBioはランダム
• ONTはランダムという話も聞くが、実は決まった場所に必ずエラーが入るというユーザーのポスターも見るので本当のところはわからない

【コンセンサス配列の精度】

• PacBio：エラーがランダムに入るので20～30カバレッジでQV50（99.999%）も可能
• ONT：ONTだけのデータでQV50を達成している結果は私は聞いたことが無い。たいていイルミナデータをエラー補正に使っているようである

とまあ、ここまで読んで、いやそんなことは無い！と思った方もいるでしょう。

あくまでバイアスがかかった私見ですので。

この辺の技術の数字は、すぐに変わる可能性があります。少なくともPacBioは、来年データ量が増える予定なので。この辺はONTとの競争ですよ

【ベースコール】

• PacBio：装置から出てくるデータは既にベースコール済み
• ONT：ベースコーラーが数種類あるのでユーザが適切なものを使用してベースコールをかける必要がある

【PacBioしかできない解析】

• CCS：ライブラリを1分子DNAの単位で何度も繰り返し読むことができ、精度を上げることが可能。Iso-Seq（完全長cDNAを高い精度で読む解析）ができる

【ONTしかできない解析】

• ダイレクトRNAシークエンス？　今どこまで現実的に使えるのか、知っているひといたら教えてください

【PacBioでもONTでもできる解析】
これはいつくかリストした後に考えてやっぱり消しました。というのは、「できる」という言葉の定義がひとによってさまざまだから。
バクテリアのゲノムアセンブリができる、と言っても、精度99.99%以上でできるというのと、ラフなドラフトでいいからできる、というのとでは全然違う。
HLAなどのロングアンプリコンシークエンスもそうです。求められる精度が6桁なのか8桁なのかで同じく「できる」というべきか。
あと、メチレーションや16SなどでもONTのデータを私は知らないのでできると言うのはやめました。
あと、意外と知られていないことですが、ノートPCにUSB挿してランができるMinIONも、データ解析には普通のサーバが必要です。

それでは技術以外の、それぞれの特徴を考えてみましょう！

【PacBioの特徴】

• 装置型なのでシークエンスを行う環境が安定している
• 実験プロトコルが用意されている
• 解析パイプライン（マッパーやアセンブラ）がほぼ確立されている。これを使っておけば大丈夫的なツールがある
• グローバルに数百台入っていて、国際プロジェクトにも正式採用されている（例えばG10K（脊椎動物のゲノムプロジェクト）ではPacBio、10XGenomics、Hi-Cのみが正式採用）ので信頼が高い
• PacBioを使った研究の論文数、学会でのポスター数は圧倒的にONTのそれより多い（これは先行者だからかもしれません。来年が勝負の年かも）

【ONTの特徴】

• MinIONはコンパクトで持ち運べる
• 初期投資額が少なくて済む
• 誰でもどこでもいつでもシークエンス、を謳っているが、「どこでも」シークエンスをするとデータにバラつきが出やしないか？（逆に、誰がどこでランしても一定のデータが出てくるなら凄い）
• ユーザーコミュニティの中からプロトコルや解析ツールが作られる、ボトムアップなイメージ。NGSは昔からサードパーティのツールがユーザーから作られるものだが、ONTはよりその傾向が強いように感じる
• バージョンアップのスピードが速い。PacBioもそこそこ速いけれどONTはもっと速いイメージ

と、つれづれなるままに書いてみましたが、いかがでしょうか？
結局はコストだと言われるかもしれませんが、シンプルにランニングコストで比較すればPacBioも負けていませんよ。アプリケーションによっては。

結論！
PacBioやONTのどちらも持っていない場合：

• どうしても自分でランしたくて、ユーザーコミュニティでどんどん聞いて行くのが好きで、インフォマティクスにも強ければONT（ベースコールも何種類かあるのをお忘れなく）
• 自分でランすることにはこだわらず、安定したデータを早く出したい、インフォを誰かに頼めるか自分でできれば、受託か共同研究でPacBio
• 限られた予算を無駄なく効果的に使いたければ・・・　（答：  　　　）

PacBioを持っている場合：
迷わずPacBio（笑）　これ一本！

以上、2017年11月現在の私の意見でした。