Single Cell Sequencing と Single Molecule Sequencing - シングルセルと一分子 (2)

G&T-Seq

G&T-seq って何だ？
Nature Methodにのるくらいだから、何か新しいすごい方法かな？と思って読んだら何と、" Genome & Transcriptome " シークエンスとのこと。

えっ？

でもこの論文、シングルセルから、ゲノムDNAとmRNA(完全長)を同時に分けて抽出し、シークエンスできるというところがすごい、らしい。

Macaulay et al. (2015) Nature Method

先ず、シングルセルは、フローサイトかマニュアルで分離した後、溶解。
そしてビオチン化されたSMARTer&オリゴdTプライマーと混ぜる。
オリゴdTは細胞内のmRNAのPoly-Aと結合するから、これでmRNAを釣ることができる。
このプライマー、ビオチン側にはストレプトアビジンでマグビーズが結合されているので、後で磁気で吸着させて他と分けることができるというわけ。

そしてPoly-A付きのmRNAと、ゲノムDNAを分けたら、mRNAは完全長を増幅。
ゲノムDNAは、全ゲノム増幅（Whole Genome Amplification: WGA）したそうです。
WGAは2種類、Multiple Displacement Amplification (MDA)と、PicoPLEX (Rubicon Genomics社のWGA)を使用した。

WGAの良し悪しは、色々議論があると思いますが、PicoPLEXで増やした方のゲノムはコピー数解析に用いられていました。
一方MDAの方はHiSeq Xシステムでがっつり全ゲノムリシークエンス、&　SureSelect でターゲットを決めた後HiSeq 2500ラン。

転写産物の方は、ビーズで回収してきた後、直ちに逆転写酵素SuperScript IIでcDNAにし、KAPA HiFi Hotstart ReadyMixでシークエンスに必要な量まで増幅しています。
完全長を保ちつつ均一にcDNAを増幅できれば、PacBioシークエンスもできるわけです。

本論分では、1セルあたり2 SMRT Cell を使用してPacBioシークエンス（x 4セル）、当然Iso-Seq、しています。
2 SMRT Cellという数字から、恐らくサイズセレクションはしていません。
Iso-Seqでコンセンサスを出すまではSMRT Analysisで行い、その後ゲノムにマッピングする際はBLATを使っていました。BLASRではなく。

Nature Methodなので、メソッドに注目を置く論文ですから、サイエンス上の発見ということはあまり書かれていません。
シングルセルで、ゲノム変異とmRNA、特にアイソフォームを見ることもこれで可能になったということがすごいですね。

Single Cell Iso-Seq というのがいよいよ現実になった !!

Single Cell Sequencing と Single Molecule Sequencing - シングルセルと一分子

今年の5月は暑い！6月も暑い！何でこんなに暑いのか。
巷ではクールビズならぬ、スーパークールビズ、というものがあるそうで、何でも「暑い夏は、アロハシャツやポロシャツで仕事しましょう！」という試みらしいです。
「なーんだ、いつもやっていることじゃん」って思ったあなた、時代を先取りしてますね。

でもビジネスマンとして、客先にアロハで行ったらきっとびっくりされる。
日本で根付くにはまだまだ10年くらいかかるでしょうか。
ビジネスアロハ、とか普及すれば良いのに。
ハワイではオフィシャル用のアロハ、沖縄でもフォーマル用のかりゆし、というのがちゃんとあるように。


さて、今日はシングルセルのはなし。

Single Cellというのは文字通り1細胞
Single MoleculeというのはPacBioのシークエンス原理でもある、1分子

この2つ、文字が似ているせいか、混乱される方が非常に多い。
1分子というのはここではDNAを増幅せずに1分子をそのまま読むということで、Single Molecule シークエンスという使われ方をします。

Single Cell シークエンスというと、1つの細胞からDNAまたはRNAを抽出し、その1つの細胞内にあるゲノムや、1つの細胞内で発現している遺伝子をシークエンスするという意味です。
がんのように、細胞ごとに異なるゲノム変異を持っているような環境を研究対象にしたい場合、シングルセルで読むことは非常に意味があります。

Vollmers et al. PLoS One. 2015; 10(1): e0117050

Human Immunoglobulin (IgH)のスプライスアイソフォームをシングルセルレベルで明らかにした
論文です。
タイトルだけを読むと、PacBioのIso-Seqを、シングルセルでやったのか？と思ってしまうかもしれません。
でも中身を読むとそうではありませんでした。

Vollmers et al. 2014

シングルセルで読んだのは上の方
Single B-Cell RNA-Seqは、フリューダイムのC1システム&Nextera XT transposaseでイルミナ用のライブラリを作り、MiSeqとHiSeqを使って行なっている。
一方PacBioシークエンスは、B-Cell RNAサンプルをバルクで集めて行なっている。シングルセルではありませんでした。
バルクとはいえ、B-Cellにて発現しているIGH遺伝子のアイソフォームをPacBioのロングリードで一気にシークエンスする。
その結果、新規のアイソフォーム（Alternative Transcript）が複数見つかった。
これら新規アイソフォームは、SangerシークエンスでもValidationされて、確かに存在することが確かめられた。

で、既知・新規含めたIGHアイソフォーム配列が求められた上で、C1使用してシングルセルで読んだショートリードRNA-Seqデータを、それらと比較する。
どのセルでどんなアイソフォームが発現していたのか、わかるわけです。

なーるほど。

最初からPacBioだけで全てをやろうとしないで、ショートリードとの見事なコラボレーション！
シングルセルのアプリケーションとして、参考になりますね。

NGS現場の会２０１５まであと１ヶ月と少し

NGS現場の会、第４回大会は、皆さんもう事前登録しましたか？
我がPacBio事業部からは１つのセッション、５つのポスターを出します。

先週、東京大学本郷キャンパスの山水会館で、企業を集めた説明会がありました。
NGS関連の会社が一同に集まることはあまりありませんよね。
説明会は特に、私たちは毎回参加しているので、滞りなく終了、
その後は懇親会。

競合の会社同士が、微妙な距離を保ちつつ、ビールを注ぎあっている姿を観察しながら、いろんなひとと話してきました。

この学会は、「スーツ禁止！」とまでは言わなくとも、できるだけスーツ以外で参加することが望ましいんです。私服か、企業T-シャツ、ポロシャツ歓迎、とのこと。
暑がりの私にはありがたいです

ところで今回は７月１日から３日、つくばの国際会議場です
企業セッションは１日目にかたまっていますので忘れずに！
私も１日目の午後４時からセッションです

我々企業の連中は、セッションが終わったあと、ブース設営がありますので初日はちょっと忙しいかなあ。でも飲みは忘れない

２日目は朝８時から夜８時半までなのでかなり長い
夕方から始まるミキシングは、食べ飲みOKなディスカッションセッションですね
企業からの差出しは大歓迎と言っていましたので、今回は何を出そうかな・・・


ポスターとか企業セミナーとかで、今一生懸命話題を考えているのですが、この業界、情報のアップデートが早すぎるのです
なので直前にならないと書けない！　スライド作れない！
６月中旬には書き始めて、ギリギリに完成！というふうに今回もなるんだろうなあ。

ちなみに今、セミナーのトピックに入れようと考えているのは、

1. Target Enrichment with Roche NimbleGen kit
2. Very large "30 kb" library construction
3. Isoform sequencing

そして、持ち時間のうち１０分くらいは、PacBioとは直接関係ないけれども面白い、NGS関連の話をしようと思います。
お楽しみに！

ターゲットリシークエンス 続き 一般論

2回にわたって、PacBioでのターゲットリシークエンスについて書いてきましたが、今日はPacBio関係ではありません
Pacは次回までお休み


ターゲットリシークエンスをした後の解析のひとつが、変異検出です。
そういえば、この「パックマンの挑戦」ブログを始める前に書いていた、「ショートリードの憂鬱」ブログでは、良くこの変異検出について書いたものでした。

見返したところ、2011年7月に、「Exome 解析　non-synonymous SNVを見つけた後は・・・」というタイトルで、SNV（SNP）を見つけた後に行なう解析あれこれ、みたいなことを書いていました。
今から4年前、フリーツールを駆使して、見つけたSNPをフィルタリングしたり、意味付けしたり

人類遺伝学会などでは毎年、ヒトゲノムリシークエンス、エキソームシークエンス、など、NGS（主にショートリードだけど）を使用した大規模プロジェクトの発表を聞きます。
特にアメリカは、やたらヒトゲノム読んでいますね。大きな病院を拠点にして、周辺の大学や病院と、患者ゲノム情報を共有する、、、なんて話を3年前のASHGでも聞きました。

遺伝子検査ビジネス大手、deCODE社やAmbry Genomics社も、やはりヒトゲノム、またはエキソームを読んで、検出したSNVを、データベースと照らし合わせて意味付けをしています

そういう会社、大学、プロジェクトは大抵、解析パイプラインが決まっています
どのゲノムリファレンスを使うか、マッパーは何を使うか、変異検出ツールは何をつかうか･･･等
逆に決まっていないと、後でデータ間比較をしたいときに整合性がとれない

例えば、BWAでHG19にマップしてGATKで変異コールして・・・という流れでも、途中のfastqフィルタリングやマッピングパラメータ、冗長性除去の有無など、いろいろ決めなければいけない項目はあるはずです

さて、決められたルールに従って変異が検出されたとしましょう
この後はその変異の意味付けです

意味付け？

先の「ショートリードの憂鬱」ブログにも、いろいろSNVフィルタリングを紹介したのですが、ナレッジを使った意味付け、というのもあります

ナレッジって何でしょう。これは論文や発表、色んな種類の公開データを、人間が精査して集めたデータベースです
SRA（sequence read archive）のようなNGS配列データベースは、中身のデータ量が爆発的に増えていますが、ここではナレッジに入れないでおきます。

ナレッジのわかりやすい例は論文です。
世界最大の医学生命科学論文データベース・MEDLINEは、今や2400万件の論文を保持しているそうです（5年前くらいまでは、1400万件と言っていましたからその増加分たるや！）

論文をまとめて遺伝子同士の関係や、化合物との関係をまとめたデータベースが、実は結構価値あるんですよ。
私も前職でPathway Studioというソフトを扱っていたのでわかるんですが、遺伝子を中心にして
周辺のレギュレーターとかを検索するのが、わずか数分でできてしまうんです
残念ながらこのソフトは某大手出版会社に買収されてしまいましたが

で、そのころはマイクロアレイなどの実験の解析に、論文ナレッジデータは使われていたのですが、今や時代はNGS（と言ったらアレイやっているひとに怒られるかな？　アレイはアレイで、良いところたくさんあります！）

先のようにリシークエンスをして、変異解析をしたら、VCFというフォーマットのファイルでSNVを表現すると思います。
このファイルには、SNVの場所情報が記載されている
どこの遺伝子のどこに変異があったか、がわかる

そんな遺伝子が、今わかっている遺伝子間の制御関係において、どこに位置するのか？
それはどんな機能のパスウェイに影響するのか？
変異が起こったことによって、どんなフェノタイプに関連すると示唆されるのか？

というような情報がナレッジによってわかってくるのです。

さ、前置き長くなりましたが、そういうナレッジの解析をクリック＆クリック、簡便化して行うことができるソフトウェアがあります。
～Ingenuity Variant Analysis～

自社の製品の宣伝になってますが、今、市場にあるどんなソフトウェアより使いやすいしわかりやすい
Pathway Studioもここまで頑張れば良かったのに・・・　と思ってしまいました

5月29日まで無料解析キャンペーンをやっています
このチラシの裏面のチャートがわかりにくい、という方、とりあえずNGS使ってヒトでリシークエンスやっていて、VCFまで出したけど、変異の絞込みこれでいいのかなあー？ってちょっと不安に思っていて、まあアンケートに協力してやってもいいかな？　
って思っているひとなら誰でも申し込みOKです
申し込みはこちら

このソフトで使われているナレッジは、人間が実際に論文を読んで集められたもの。
すごい人海戦術です。インド人恐るべし

しかし将来は、人工知能がこういうナレッジを作るのでしょうか
2045年問題（コンピュータが人間の脳を超える日）というのがありますが、コンピュータによる論文からのナレッジ抽出は、実は前述のPathway Studioで10年前に実現されていました。
もちろん完璧ではなくミスもありました。（ああ懐かしい！ちなみにPathway Studioはロシア製）


2045年は今からちょうど30年後
30年後を待たずとも、データベース検索や、もっと言えばシークエンスデータからのフェノタイプ予測などが、人工知能で全部できる時代が、意外と早く来る予感がします。
そうなったとき、世界はどうなっているのでしょうね。

今から30年後

子供の世代の生命観は、全く予想がつきません

PacBio-LITS PacBioでターゲットリシークエンス 2

ターゲットリシークエンスの話の続きです。

Roche-NimbleGen社では、いくつかのエンリッチメントキットを用意しています。
SeqCap EZ Designs というキットをPacBioでは試しているそうです。

• Comprehensive Cancer Design
• Neurology Panel Design
• Human MHC Design

などなど

先のアプリケーションノートで、紹介されている例は、Human MHCとComprehensive Cancerの2つ

このアプリケーションは新しすぎるのか、まだWebsiteにUpされていません
そのうち www.pacb.com/target から落とせるようになると思います

ま、SeqCapEZ のキットで、平均6kbのフラグメントを濃縮できた、ということはすごい！
ゲノムにアラインした様子がこちら

BRCA1遺伝子、上がPacBio、下がIlluminaのデータです
PacBioのデータは、長いのでイントロンまでカバーしているので、イントロン部分のSNVも検出しています


こちらは35kbの長さの遺伝子

あれ？　カバレッジが均一でない
それは、おそらく、エンリッチのときの、PCR増幅バイアスでしょうか？

PacBioで行なうターゲットエンリッチメントは、せっかくなので、ロングリードで読むことに意味がある使い方をしないといけませんね
それにはどんな使い方があるか？

ある程度場所が既知の、Fusion Geneのところだけを読む？
数遺伝子だけに絞って、その遺伝子のSNP Phasing を調べる？
そのほかにも、アイデア次第では面白い実験が考えられそうですね。

Phasingといえば、エンリッチしてPacBioで読んだデータ、Reads Of Insertをゲノムにマップした後、Samtoolsを使ってphasingを見ることができます。
Samtoolsでそんな機能があったのか！と驚いたのですが、ここに詳しくやり方が書かれています。

このツールは、SMRT Analysisが入っているサーバで行なうことが前提です
ちょっと、Reads Of Insert mappingなどの基礎知識が必要です

とりあえず、Bamファイルやリファレンスファイル、SMRTCellデータのパスなどを指定して、シェルを流すと、数分で結果は返ってきました

たくさんのファイルが出力されますが、とりあえず表示してみたいのはprefix.0 と1の二種類のマッピングファイル
これがphasingを分けている、らしい

ちなみに私はまだエンリッチされたPacBioデータが手元になかったので、HLAのアンプリコンシークエンスをわざわざReads Of Insert マッピングして、染色体6番のHLA遺伝子近辺だけを見ました

なんか、カバレッジ深すぎ…
IGVはメモリを食うので、深すぎるカバレッジはダメ

そして phase.out ファイル
これはSNP phasingの結果らしいです

PSのところにphase set のSNPが出るはずなんだが
SNPの数が妙に少ない気がする
これはHLA-A、B、Cの遺伝子部分を増幅したアンプリコンのはず
…

アプリケーションデータで紹介されている、もう少したくさんの遺伝子エンリッチメントのデータでは無いので、イマイチ結果の解釈まではできませんでした
ツールが動く、ということを確認したのみ

サンプルデータで試してみたいですね

というところで今夜はおしまい

PacBio-LITS PacBioでターゲットリシークエンス 1

今日は4月5日、東京は雨が降って、せっかくの桜も散ってしまっています。
今年ほど、桜満開の時期が短いと感じたことはなかったなあ。
7月のNGS現場の会に向けて、「お花見メタゲノム」の試料採取が、全国で行なわれているみたいですね。
私のFacebookの友人も、採取の様子をいろいろアップしていまいた。
結果が楽しみです！

さて、今日は、PacBioではあまり今まで話題に出てこなかった、ターゲットリシークエンスの話

リシークエンスには大きく分けて、全ゲノムリシークエンスと、ターゲットリシークエンスの2種類あります。
前者はゲノム全体をガッツリ読む方法で、後者は例えばExomeなどのような遺伝子のエキソン領域だけを濃縮して読む方法です。
濃縮キットは（「エンリッチ」キットとも呼ばれますが）、ゲノム配列を断片化したあと、

1. 取ってきたい（シークエンスしたい）配列領域にデザインされたプローブをハイブリして、エンリッチする方法
2. 読みたい配列の両端にPCRプライマーを設計して、そこだけPCR増幅して、取ってくる方法

の2種類あります。

ハイブリ方式か、PCR増幅方式か

市場で良く聞く製品だと、SureSelect (Agilent社)や、SeqCap EZ (Roche社)などは、ハイブリ方式

Ion AmpliSeq(LifeTech社)は、その名の通り、Amplification（増幅）方式

これまで、どの方式、どのキットも、PacBioのロングリードには対応していませんでした。

PacBioで読むには、エンリッチした後の配列長が、そこそこ長くなくては意味が無い！

そんな中、ハイブリ方式で6kbフラグメントのターゲットエンリッチメントに成功したのが、この論文

Wang et al. BMC Genomics (2015) 16:214

Baylor College of MedicineのDr. Min Wangらは、彼らのエンリッチ方法を使って、Potocki-Lupskiシンドロームの患者に見られる、chr17p11.2の複雑な構造変異、Low Copy Repeats (LCRs; またはSegmental Duplications )のブレイクポイントを、検出することに成功しました。

そもそも何で、ゲノム全体を読まずに、特定の箇所をエンリッチして読むのか？

興味のある場所がゲノム全体の数%だったら、そこだけを濃縮（エンリッチ）してきて、PacBioの超ロングリードでがっつりカバレッジ稼いで読めば、かなり消耗品を節約できます。
ゲノム全部を読む必要が無いひとにとっては、エンリッチメントはかなり効率的な手段なのです。

彼らは、Roche NimbleGen社の、SeqCap EZ エンリッチメントキットを使用して、つまりハイブリ方式で、ターゲット領域を濃縮、PacBioで読むことに成功しています。
この方法は、PacBioのアプリケーションノートでも紹介され、今後、本格的に広まる予感がします。

通常、SeqCap EZのプローブは、200bpのフラグメントに対してハイブリするようデザインされています。
これを、彼らは、6000bpのフラグメントでも可能であることを示しました。

まず、ゲノムDNAを、G-tubeで10kbに断片化します。
その後、Blue Pippinというサイズセレクション機器を使ってゲル泳動し、5~9kbの長さのフラグメントだけを抽出します。
SeqCap EZ アダプターをつけたあと、増幅し、プローブとハイブリします。
ハイブリしなかったDNA断片（濃縮ターゲットではない部分）をWashして捨て、ハイブリした断片（濃縮ターゲット）を回収します。
もう一度、回収DNA断片を増幅し、それからSMRT Bellライブラリ作製にかかります。

このようにして、ハイブリ方式で濃縮したDNA断片から作製したライブラリを、実際にシークエンスしたデータは、かなりの数のライブラリが6kbのサイズを保っていたことを示しました。
実際にHG19ヒトゲノムリファレンスにマップしたところ、マップされたReads Of Insert（ライブラリの長さにほぼ等しい）の平均長は、4.3kb～4.7kb
これだけの長さのリードを濃縮できた例は、私は聞いたことがありません。

論文に出ているとはいえ、まだこのプロトコルはPacBio公式ではありません。
もし試してみたい方は、うまく行かない可能性も無くは無い、ということを頭に入れて、お試し下さい。

どんな遺伝子でもエンリッチできるのか？
SeqCapEZ のプロトコルにはどんな工夫があるのか？
データ解析ツールはどんなふうに使ったら良いのか？

などなど知りたいことはありますが、またフォローしていきますのでお楽しみに！

PacBio RSIII - Maestro -

皆さん、PacBio RSが大きなシークエンサーだというのは知っていますよね？

横幅2メートル、高さ1.6メートル、重さ1トン

こんな大きなシークエンサーは、今後、出てこないでしょう。

でも、アメリカのあるラボでは、特注でもっと大きなマシンを導入しているんですよ。

PacBio RSIII -Maestro- 

この機械は、3ランを同時にできる、総重量5トンのモンスターマシンです。

レーザー、カメラは普通の3倍搭載

ロボット系を調整して、同じ時間に3倍のスループットを出せるようにしています。

3ランを同時にできるということは、最高で、48 SMRT Cell = 平均10Kbのリードからなる塩基が30～40Gb出力されるということ

もはや、ヒトゲノムのデノボアセンブリもこれ一台で、1～2回のランでできてしまう！

今、アメリカで2台、このMaestroは動いています。　一箇所は、Venter博士のところです。

価格は・・・　そこそこします、が、某社の10台セットに比べれば安い安い。

日本の研究室には、サイズ的に入らないでしょうね。

残念です。

と、まあここまで来て、というか最初から？気づいていたと思いますが、

これは、ジョーク！

エイプリルフール、は、昨日だったか（笑）

でもアメリカ時間ではギリギリセーフ