SMRT Link 4.0公開

PacBioの解析ソフトウェアといえばSMRT Analysisですが、これは基本無料のソフトウェアです。
「基本」というのは、ダウンロードして使うのはご自由にどうぞ、という意味です。
ただ、使い方やサポートとなると、PacBioの装置を持っているかたはもちろん優先して行いますが、そうでない方は後で・・・ということになってしまいますことはご理解ください。
その代わり、GitHubや、ダウンロード資料、無料の解析ワークショップなどは、定期的にアップデートしていますのでそちらをご覧ください。

と、言い訳っぽいことを書きましたが、正直、無料のソフトなので。

さて、Sequel用にはSMRT Linkというパッケージソフトが用意されています。
その中にはもちろん、Sequelデータの解析ソフト、SMRT Analysisが含まれています。
Sequel用のSMRT Linkは2017年4月現在、バージョン4.0で、ここからダウンロードできるようになりました。

チュートリアルなどのビデオやインストール資料も、少しずつですが充実してきています。

と、いうことですが、まだSMRT Linkはインストールにハードルが高いかもしれません。
サーバのスペックはかなりのものを要求します。
推奨は、ジョブエンジンで動くクラスターサーバです。
例えば、ヘッドノードは64Gbメモリ、32コアCPU、計算ノードは256Gbメモリ、1Tbのローカルディスク容量、これが6ノードで合計96CPU コア
この例は、大型ゲノムをアセンブリして、1週間くらい待てるお客さん向けです。

でも、
Falconも入っているし、この環境を作ってからなら、Falcon Unzipもうまく動くようになったという報告もあるので、うまく動かないで困っているひとは先にSMRT Link 4.0をいれてみることをお勧めします。

まずは資料やらチュートリアルビデオやらを見てくださいね！

沖縄からのレビュー論文

日本にPacBio RSを初めてインストールした、本当に最初の最初のお客様の中に、沖縄綜合科学研究所、があります。
こちら、沖縄県うるま市の沖縄バイオ産業振興センター内にあり、もちろん何度も行ったことがあります。
これまでにもPacBio現場の会や、PacBioアジアユーザーミーティングでのご発表など、いろいろとご協力頂きました。

さて、3月31日にPublishされていて、ここでも紹介しようとしていてうっかり忘れていたレビュー論文があります。お客さんが書いた論文の紹介なのに「忘れていた」とはなんとも申しわけない。
でもファーストオーサーの中野さんは、優しいひとなので許してくれるでしょう。

沖縄綜研さんでは、これまでに本当にたくさんのサンプルを、RS/RSIIを読んできました。
PacBioの一分子シークエンサーが、ゲノム解析や構造解析、メチレーション解析、SNPフェージング解析にいかに優れているか、をよーくご存知です。
私が言うより、実際のお客さんが言うほうが、説得力ありますよね。
ちなみにロングリードの記録として、92.7kbのリード長を2016年11月に出しているそうです！（もうちょっとで100kbでしたね）

このHuman Cell レビュー論文の中では、さまざまな種が登場しますが、その中からほんの少し紹介します。論文は無料みたいです。
PacBioの、GCバイアスの無いロングリードだからこそ読めた例の数々です

Mycobacterium tuberculosis　（結核菌）
4.4MbでGCが65.6%のGCリッチゲノム。ゲノム中にはGCが80％に達する2,000bp以上の配列部位が存在し、1,000bp以上のまったく同じ配列ペアが117か所あるとのこと

MDR Acinetobacter baumannii （多剤耐性菌アシネトバクター）
4Mbの染色体と189kbのプラズミドを持つ。どちらもGCが39%程度の低GCゲノム。
多剤耐性の遺伝子の位置を同定

Carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa 　(カルバペネム抗生物質耐性緑膿菌)
6.85Mb、GCが66%のゲノム
ゲノムには、10,000bp以上（最長27,239bp）の同じ配列ペアが6か所あり、これらはプロファージとのこと

Helicobacter pylori （ピロリ菌）
沖縄は、内地と比べて胃がんの割合がとても低い。これは胃がんの原因として近年言われているピロリ菌の種類が違うからではないか？という話。
ピロリ菌の毒性とcagA, vacA遺伝子のジェノタイプをプロファイリングし、さらにはメチレーションとの関係性も明らかにした例

ほかにも、沖縄由来のバクテリアや、インフルエンザウイルスのゲノムを解析した例、ヒトのCM-SJS（スティーブンス・ジョンソンシンドローム）/TEM（中毒性表皮壊死症）関連IKZF1遺伝子のターゲットアンプリコンシークエンスをして新規にSNPフェージングを発見した例など、これまでの成果は相当な数に上ります。



と、お客さんをよいしょしたところで、今日はこれくらいに。

Dovetail レタスゲノム論文

すみません、最近ブログ更新をさぼっていました。
私事ですが、年度末に7年ぶりの引っ越しをしまして、そのうえ国内・海外の出張が重なり、ブログのことが後回しになっていました。

引っ越しのタイミングで買うものといえば掃除機。
前の家ではルンバを買ったのですが、今度はダイソンのハンディ掃除機。
これ、凄く良いですね。毎日使ってます。

さて、3月末の育種学会は名古屋でした。
愛知県はキャベツの生産量日本一だそうです。意外ですよね。
キャベツと似たような野菜にレタスがあります。では、
レタスの生産量日本一は？
正解は長野県です。これは、やっぱりね、という感じ？

レタスは学名　Lactuca sativa　というそうですが、染色体の数は９対、18本。
ゲノムサイズは約2.5Gb
リピートが多く、植物らしい？　ゲノム構造だそうで。

今日紹介する論文は、まだPacBioは出てきませんが、DovetailのChicagoメソッドを使ってレタスのゲノム解読を行った例。これです

このレタスゲノムの場合、ショートリードだけで行ったドラフトアセンブリのN50は、
コンティグレベルで36kb
スキャフォルドレベルで476kbでした。

これが、HiSeq 2レーン分のシカゴライブラリデータを加えただけで、スキャフォルドN50 が1.8Mbになったというのだから驚き！

”The Dovetail technology greatly increased the contiguity of the assembly, assimilated additional scaffolds into chromosomal pseudomolecules, identified chimeric scaffolds that had been missed by genetic analysis, and oriented and ordered scaffolds through complex regions. ”

さらに、この論文には間に合わなかったみたいですが、彼らは追加でもっと凄いデータを出しています。
論文に使われたシカゴライブラリは、およそ150kbのゲノムDNA分子から作られたそうです。
そのあとDovetailでは、400kbシカゴライブラリを作りました（ultra high molecular weight Chicago）。
でそのデータを加えたらN50 は6.51kbに！
さらにさらに、Dovetail Hi-Cライブラリ（細胞内でChicagoライブラリのようなものを作る）も作って追加したところ、9本の仮想染色体を再現できるところまでできたそうです！！

もちろん9本の仮想染色体は、Nを含むスキャフォルドです。
彼は今、PacBioのデータを取得し、ギャップフィリングに挑戦中だそうです。
またさらにHi-Cを追加して、テロメアからテロメアまで、の完全染色体配列の再現を目指しているらしいですよ。

さて、そんなDr. Michelmoreのウェビナーが来月31日にあります。
Dovetail の技術に興味のある方、ギガベースのゲノムアセンブリに苦労されている方、PAG Asiaに行けないけれども情報仕入れたいかた、ぜひ参加ください。
こちらから登録

と、誘っておきながら、時間が悪いんですよね。なので録画が予定されています。
登録者にはリンクが行くはず。
もし参加し忘れた、けど録画が見たい、という方は私まで直接お知らせください。
NGS現場の会でも、Dovetailのセッションを企画しましたのでよろしくです！

サイズセレクション無しのISO-SEQ Sequel向け

Iso-Seqというのはアイソフォームシークエンス。
数年前から（もちろんそのときはRSIIで）、完全長 cRNAをシークエンスすることで、スプライシングのバリエーションを一気に、連続配列情報として得ることが出来る。
これがIso-Seq です。
最近ではここに書きました
Iso-Seq アイソフォームシークエンスアップデート 植物

RSIIでのIso-Seqは、サイズセレクションといって、1kb、2kb、3kbなど、サイズごとに分けてライブラリを作製、別々のセルでシークエンスしていました。
と・こ・ろ・が・！

このたび正式にリリースされたSequel用のプロトコルでは、サイズセレクションしません。
というのも、Sequel用のケミストリーでは、ローディングバイアス（短いライブラリが優先的にZMWに入る、というバイアス）が、あまり影響しないらしいことが経験的にわかってきたからです。

RSIIとSequel、サイズセレクション無しのとき
Sequelのランはバイオアナライザで測ったときの波形に似ている

サイズセレクションせずに、Iso-Seqの同じライブラリをRSIIとSequelでランしたとき、RSIIは1kb程度のフラグメントがもっとも多く検出されます。
でも、Sequelでランすると2kbあたりに最頻値が現れる。
これはバイオアナライザで測ったときの形に似ているぞ。
ちなみにAMPureは1Xで行なっています。

というわけですが、マグビーズは推奨されています。
また、4kb以上の長い転写産物の出力を増やしたい場合は、4.5kb以上でサイズセレクションをしたほうが良いらしいです

そのたの目新しいこと・・・

• AMPure精製は、0.40Xと1Xの2通り別々に行い、あとでモル比を合わせて混ぜます
• PrimeSTAR GXLポリメラーゼを長鎖PCRに使います
• P1を50%目指します（50%のZMWから使えるデータを出す）
• 6時間Movieまたは10時間Movieで読みます（時間かかっても精度良いデータをたくさん出したければ10時間）
• Movieをとる前に2時間シークエンスさせます（Pre-extensionと呼ぶ）

このような変更点があって、プロトコルもだいぶ変わりました。

Sequel では、RSIIで複数個のセルを使っていたIsoSeqが、1個か2個のセルで可能になりました。

今度のAACR（4/1～5）で発表があるかな。

注目してます。

Iso-Seqの新しいプロトコルはこちらから！

バクテリアマルチプレックスシークエンス

Sequel のスループットは、RSII より多いです。

Movie時間やライブラリの種類によって変わりますが、一般的にRSIIでも1セルあたり550Mb~1Gb のデータは出てきます。

一方Sequelは、3Gb~7Gb のデータが出ます。

ポリメラーゼリードの分布はこのような感じ。

1セルで7Gbものデータが出ると、高等真核生物のような大型ゲノムのアセンブリには向いているんですが、バクテリアサイズのゲノムにはそのままではオーバースペックなんですね。

そこで誰もが思いつくのがマルチプレックス。

バーコードをつけて、多検体を一度にシークエンスし、解析のところでバーコードごとに振り分けて検体ごとにHGAPする方法です。

その公式プロトコルができあがりました。解析ワークフローはこちらにあります。

この方法を簡単にまとめると

• 10kbライブラリをつくる（ゲノムを切るとき10kbをターゲットにする）
• ゲノムを切った後はExo VII酵素で切れ端一本鎖を処理する
• バーコード付きのダンベルアダプターをDNAの両端にライゲーションする
• ライゲーションした後複数サンプルを混ぜる
• 5Mbゲノムなら12サンプルまで、2Mbゲノムなら16サンプルまで一度に混ぜることができる（Sequelのとき）
• サイズセレクションにBlue Pippin は使わないで、0.45X AMPure PBを使用する
• 解析はSMRT Link4.0 以降のソフトウェアで行なう

なぜ20kbでなく10kbライブラリを作るのか？
バーコードはインサートDNAの両側のアダプターについています。
そのアダプター配列を正しく読むためには、10kbくらいがちょうど良い長さなのです。
もちろんもっと短くても、ほとんどのポリメラーゼが端っこのアダプターまで到達するでしょうが、あまり短いとデノボアセンブリに向きませんね。
20kb のインサートだと、端っこのアダプターまで到達するポリメラーゼの数は半分以下か、もっと少なくなります。
それでは得られるデータが少なくなるのでマルチプレックスする意味が無い。

バーコードを認識するにはアダプターまで読みぬかないとダメ

ライブラリの長さとバーコード認識の比率はトレードオフの関係なんです。
ということは、ですね、とても長いリピート配列を含むゲノムには向いていないのです。
30kbのリピートが存在するゲノムをつなげるには、30kb 以上のライブラリが必要。
それだとバーコードまで届かない・・・。ジレンマ

でも、そこまで長いリピートを持たないバクテリア、または染色体を完全につなげなくても良い場合などはマルチプレックスをすることでコストを大きく引き下げることができます。

必要ゲノムDNAの量は？
DNAシェアリング（切断）した後のステップは、Exo VII酵素処理です。
ここで必要な検体あたりのDNA量は、
4マルチプレックスの場合：250ng
8マルチプレックスの場合：125ng
10マルチプレックスの場合：100ng
12マルチプレックスの場合：83ng
全体量で1μgがあれば良いのです

バーコード付きのアダプターは自分で作るの？
売ってます。PacBio Barcoded Adapter Complete Prep Kit.という名前で。
お勧め配列があるのでそれをつかいます

混ぜるときの注意点は？
DNA切ったときの切れ具合が、混ぜるサンプル間で似ていることが重要！

10kb狙って切ったとして、Bioanalyzerで確認して、もしも大きく切れかたが違った場合、DNA濃度をもとにして均等に混ぜるよりも、モル数を同じにして混ぜないと、均等にならない恐れがあります。注意しましょう。


ランニングコストはいくらになる？
12種類のバクテリア（ゲノムサイズ5Mb）を、この方法でバーコード付けてマルチプレックスで読んだときの、1株あたりのコストは、55,000円（2017年2月現在・Sequelの1セル使用時）

Oxford Nanopore Technologies (ONT) と PacBio のデータ比較論文

昨日は東京も2月の雪！
20代の前半をカナダの極寒で過ごしたので寒さには強いと思っていたんですが、やっぱり年取ったせいでしょうかねえ。寒いの嫌いです。

さてさて、
先日面白い論文（まだレビュー前）を見つけました。

トランスクリプトーム解析（ゲノムアセンブリではない）で、PacBioとONTのデータを比較した論文です。
オーサーのひとり Dr. Kin Fai Auは ISO-SEQの解析に詳しく、数年前からPacBioを使っています。ロングリードがアイソフォーム解析に有効だということはとても理解しています。

中立な立場で書かれた評価論文なので、どちらにも偏りの無い記述が目立ちます。

ロングリードの欠点は、精度が低い、ということだと彼らはいいます。
確かに、転写産物の１分子を読むには、数十回もカバレッジを重ねられないのである意味当たっています。

このブログを読んでいれば分かるかと思いますが、PacBioには、CCSという同じDNA分子を何度も読むことで精度を上げる方法があります。
１本の転写産物を、何度も繰り返し読んで精度を上げるのです。
また近年では、TofuというIso-Seqの解析アルゴリズムの中で、完全長cDNAを読んだ配列同士でクラスタリングを行い、１本の転写産物をCCSで読む以上にコンセンサス配列の精度を上げる方法も有ります。
ですが、この論文では、わかりやすい CCS で比較をしています。

一方の ONT は、同じDNA分子をポアに２回通す2Dという方法があり、精度は1回しか通さない 1D よりも高いです。1D は、PacBioでいう subread に対応します。
まずはこれがその比較

エラー率に注目！

• PacBio の CCS : 1.72 %
• 対するONT の 2D : 13.40 %
• PacBio の subread : 14.20 %
• 対するONT の 1D : 20.19 %

ONTの精度はもう少し高いと聞いていましたのでびっくりしました。
試薬バージョンによるのでしょうかね。
しかし、2Dが使われなくなるかも（PacBioから特許侵害訴訟を起こされているため）しれませんから、そうすると ONT としては 1D + ショートリード補正、というのが今後の使い方になるのでしょうか？

さて、論文の中に下のような文章があります。

"Results: PacBio shows overall better data quality, while ONT provides a higher yield. As with data quality, PacBio performs marginally better than ONT in most aspects for both long reads only and Hybrid-Seq strategies in transcriptome analysis."

なるほど。
いいんじゃないでしょうか。まだまだ勝ってる（笑）。

PacBioのエラー補正にショートリードを使わなくても良い、と個人的には思いますが、一方のONTをそうやって補正しているので、比較のために同じ条件でエラー補正したんでしょうかね。
PacBioとONTのエラーのパターンなんかも述べられていて、面白いです。
もちろん、転写産物解析にどちらのデータが使えるか、というのもちゃんと比較しています。

論文のリンク、忘れていました。
ここです。　

PAG報告 パート7 最終回 プレゼン録画のお知らせ

国際学会の醍醐味は、海外でどんなことをやっているかを知ることだと思います。

必ずしも最先端とは限らないけれど、日本であまり聞かない話や、逆に日本の研究が世界でこんなつながりがあるんだ、と気づくことがあります、

私自身、国内でも育種学会や、農学中手の会や、アグリゲノム産業研究会などを通じて植物のゲノムを再勉強しています。

そんなこんなでPAGはとても面白い勉強の場でもありました。

さて、今回はPAG報告の最終回。
PacBio関係のセミナープレゼン録画やスライド、ポスターなどの情報がネットにアップされましたのでお知らせします。

ぜひこれを見て、PacBioのSMRT Sequencing がいかにゲノムアセンブリやトランスクリプトーム研究に貢献しているか、を実感して下さい。

尚、上記セミナースピーカーのうち、ErichさんはBird 10K プロジェクトのリーダーで、PacBioのカスタマーイベント（という名の飲み会）で近くのテーブルにいたからしばらく話したひと。
Benさんは、知り合いと待ち合わせていたホテルのバーで偶然隣に座っていて友達になったひと。

こういう出会いも海外学会の醍醐味ですかねえ。

上記のビデオ、プレゼンファイルのダウンロードはこちらから。